胰腺癌患者手术前后CD4-CD8- T细胞比例与IL-4，IFN-γ含量的关系
发表时间：2010-03-12 浏览次数：1309次
作者：杜敏 作者单位：安徽医科大学附属省立医院 【摘要】 目的 研究胰腺癌患者手术前后外周血CD4-CD8- T细胞比例与IL-4、IFN-γ含量变化及其相互关系。方法 分别应用流式细胞仪及ELISA法检测胰腺癌患者手术前后外周血中CD4-CD8- T细胞比例与IL-4、IFN-γ含量。结果 20例胰腺癌患者术前CD4-CD8- T细胞占CD3+ T细胞的比例为(4.13%±1.81%)，术后CD4-CD8- T细胞占CD3+ T细胞的比例为(6.11%±1.40%)，两组之间差异有统计学意义(P<0.01)。胰腺癌患者术前外周血中IL-4含量为（90.29±24.99）pg/ml，术后外周血中IL-4含量为（71.43±8.39）pg/ml，两组之间差异有统计学意义(P<0.01)；术前外周血中IFN-γ含量为（15.79±5.90）pg/ml，术后外周血中IFN-γ含量为（20.08±6.60）pg/ml，两组之间差异有统计学意义(P<0.01)。结论 胰腺癌患者手术前后CD4-CD8- T细胞比例变化可能影响IL-4、IFN-γ含量的变化，胰腺癌患者手术前后测定CD4-CD8- T细胞比例、IL-4、IFN-γ含量对判断机体的免疫水平具有一定的参考价值。
【关键词】 胰腺肿瘤 CD4-CD8- T细胞 白细胞介素4 干扰素γ
The relationship between CD4-CD8- T cells ratio of patients with pancreatic carcinoma before and after operation and IL-4，IFN-γ levels
DU Min， CHEN Jiong， LI Wenbo， et al. Department of General Surgery， Provincial Hospital Affiliated to the Anhui Medical University， Hefei 230001
Abstract Objective To investigate the relationship betweem CD4-CD8- T cells ratio in the peripheral blood of patients with pancreatic carcinoma before and after operation and IL-4， IFN-γ levels. Methods Flowcytometer was used to analyze the CD4-CD8- T cells ratio in the peripheral blood of patients with pancreatic carcinoma before and after operation and detect the IL-4 and IFN-γ levels with Elisa. Results The ratio of CD4-CD8- T cell in CD3+ T cell from 20 pancreatic carcinoma patients was (4.13%±1.81%) before operation; the ratio of CD4-CD8- T cell in CD3+ T cell from 20 pancreatic carcinoma patients was (6.11%±1.40%) after operation， significant deviation can be found between them （P<0.01）. The IL-4 level in 20 pancreatic carcinoma patients was （90.29±24.99） pg/ml before operation; the IL-4 level in 20 pancreatic carcinoma patients was （71.43±8.39） pg/ml after operation， there was significant deviation between them （P<0.01）. The IFN-γ level in 20 pancreatic carcinoma patients was （15.79±5.90） pg/ml before operation; the IFN-γ level in 20 pancreatic carcinoma patients was （20.08±6.60） pg/ml after operation， there was significant deviation between them （P<0.01）. Conclusion The CD4-CD8- T cells ratio in the peripheral blood of patients with pancreatic carcinoma before and after operation may influence the level of IL-4 and IFN-γ. To detect the CD4-CD8- T cells ratio in the peripheral blood of patients with pancreatic carcinoma before and after operation and IL-4， IFN-γ levels may have the reference value to judgement the organism immune situation.
Key words pancreatic neoplasms； CD4-CD8- T cell； IL-4； IFN-γ 胰腺癌是恶性度极高的肿瘤，易发生转移和复发，目前尚无有效的筛查和治疗方法，研究发现CD4-CD8- T细胞具有抗肿瘤作用，本研究就手术前后胰腺癌患者外周血CD4-CD8- T细胞的比例与 IL-4、IFN-γ含量的关系进行探讨。
1 资料和方法
1.1 研究对象 研究对象为2006年11月～2007年9月我院普外科所收治的胰腺癌患者，临床资料完整，术前未进行化疗和放疗，均为术后病理所证实，共20例，其中男11例，女9例。年龄43～79岁，平均年龄（60.20±8.43）岁；按组织学分化程度分为高、中分化腺癌14例，低分化腺癌6例；胰腺癌分期根据国际抗癌联盟（1997）TNM分期，其中Ⅰ期、Ⅱ期11例，Ⅲ期、Ⅳ期9例。正常对照组20例，全部为健康体检者，其中男12例，女8例；年龄23～66岁，平均年龄（39.3±13.1）岁。主要试剂：草履虫叶绿素蛋白Percp标志的CD3、异硫氰酸荧光素FITC标志的CD4、藻红蛋白PE标志的CD8、CD56抗体（均为美国Becton Dickinson公司），淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品公司），IL-4、IFN-γ ELISA试剂盒（美国RnD公司）。
1.2 研究方法
1.2.1 CD4-CD8- T细胞检测 采外周血5 ml，经肝素钠（1：9）抗凝，加入淋巴细胞分离液后经密度梯度离心后收集淋巴细胞，加入PBS洗涤2次，计数淋巴细胞，调整细胞浓度至1×106个/ml以上。取100 μl细胞悬液，加入Percp标志的CD3、FITC标志的CD4、PE标志的CD8、CD56抗体各10 μl，置4度避光孵育30 min后稀释至500 μl，立即上流式细胞仪(Beckman-Coulter公司，型号EPICS-XLII)进行检测，上机前对流式细胞仪进行光流路质量调控和双色荧光补偿，使仪器各项指标在质控允许值范围，常规采用荧光微球Flow Check 和同型阴性对照试剂对仪器进行质量监测和调控， 根据前向散射角（for-ward scatter，FSC）和侧向散射角（side scatter，SSC）对淋巴细胞群及CD3＋ T细胞进行设门；每次获取设门内5000个以上细胞，荧光激发光波长为488nm，Percp、PE及FITC荧光素滤光片波长分别为675、575、525nm，各荧光素之间荧光补偿调至标准值范围内。文件以Listmode形式保存，systemⅡ软件分析数据。
1.2.2 IL-4、IFN-γ的测定 清晨取静脉血5 ml，离心后取血清，置于-80℃冰箱保存， 血清IL-4、IFN-γ的测定采用ELISA法，操作步骤严格按说明书进行。
1.3 统计学方法 应用SPSS11.0 软件分析，采用t检验。
2 结果
2.1 胰腺癌患者手术前后外周血CD4-CD8- T细胞比例比较 术前胰腺癌患者外周血单个核细胞中CD4-CD8- T细胞占CD3＋T细胞的比例为(4.13%±1.81%)(n=20），术后胰腺癌患者外周血单个核细胞中CD4-CD8- T细胞占CD3＋ T细胞的比例为(5.74%±1.43%)(n=20），可见术后胰腺癌患者CD4-CD8- T细胞比例显著高于术前胰腺癌患者，两组之间差异有统计学意义（P<0.01）（见图1、2）。
2.2 胰腺癌患者手术前后血清IL-4、IFN-γ含量比较 术前胰腺癌患者血清IL-4含量为（90.29±24.99）pg/ml，术后胰腺癌患者血清IL-4含量为（71.43±8.39）pg/ml，术前胰腺癌患者外周血IL-4含量明显高于术后，两组之间差异有统计学意义（P<0.01）。术前胰腺癌患者血清IFN-γ含量为（15.79±5.90）pg/ml，术后胰腺癌患者血清IFN-γ含量为（20.08±6.60）pg/ml，术后胰腺癌患者外周血IFN-γ含量明显高于术前，两组之间差异有统计学意义（P<0.01）（见图3）。
2.3 手术前后胰腺癌患者外周血CD4-CD8- T细胞比例及IL-4、IFN-γ含量的相关性分析 术前胰腺癌患者血清IL-4含量为（90.29±24.99）pg/ml与CD4-CD8- T细胞比例呈负相关（r=－0.627，P<0.01，见图5）、IFN-γ含量为（15.79±5.90）pg/ml与CD4-CD8- T细胞比例无相关性（r=0.200，P>0.05）；术后胰腺癌患者血清IL-4含量为（71.43±8.39）pg/ml与CD4-CD8- T细胞比例无相关性（r=0.286，P>0.05）、IFN-γ含量为（20.08±6.60）pg/ml与CD4-CD8- T细胞比例无相关性（r=0.058，P>0.05）（见图4）。
3 讨论
胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤，易发生浸润和转移，导致术后5年生存率低。胰腺癌的发生、发展与机体的免疫功能密切相关，当机体的免疫功能下降时，机体的免疫清除以及免疫监视能力下降，使得肿瘤的发病率增高。机体的抗肿瘤免疫过程可分为细胞免疫和体液免疫两部分，两者相互配合，在机体的抗肿瘤过程中起重要作用。大多数研究发现在正常人及小鼠体内大多数T淋巴细胞为CD4＋ T细胞和CD8＋ T细胞，仅有约1％～5％的T细胞不表达CD4和CD8，称作为CD4-CD8- T细胞，研究表明CD4-CD8- T细胞具有MHC-1特异性，可能通过Fas/FasL的交互作用抑制同系基因型CD4＋ T细胞或CD8＋ T细胞、获得MHC-短肽以及细胞因子的诱导等途径来发挥其免疫抑制功能，虽然对CD4-CD8- T细胞研究越来越多，但对于CD4-CD8- T细胞的功能还不是完全清楚，尤其是对CD4-CD8- T细胞的来源争论较多，目前的研究表明CD4-CD8- T细胞可能来源于CD8＋ T细胞以及CD4-CD8- T细胞[1-4]。目前CD4-CD8- T细胞在肿瘤免疫中的作用研究较少。Young等[5]发现CD4-CD8- T细胞在抗肿瘤免疫中具有重要作用，他们把CD4-CD8- T细胞和淋巴瘤A20细胞株接种于(B6xBALB/c)F1小鼠，发现CD4-CD8- T细胞可抑制肿瘤细胞的生长，研究表明CD4-CD8- T细胞具有抗肿瘤免疫的作用，可能通过Fas/FasL途径启动肿瘤细胞的凋亡。
细胞因子是导致免疫应答因素和炎症反应因素相互作用的信使，在免疫应答过程中，细胞因子对于细胞间相互作用、细胞的生长和分化有重要调节作用。根据分泌的细胞因子类型的不同可分为Th1细胞和Th2细胞，两种Th细胞相互调节，互相抑制以此维持机体的免疫平衡，一旦这种平衡被打乱，将会导致疾病的产生。研究表明当机体内发生Th1细胞因子向Th2型细胞因子偏移时可影响机体内细胞免疫状态，利于肿瘤细胞发生免疫逃避[6-7]。
目前CD4-CD8- 细胞在肿瘤免疫方面的临床研究较少，尤其在胰腺癌中，而手术前后CD4-CD8- T细胞的表达与IL-4、IFN-γ含量的关系尚未见报道。我们的研究显示手术后胰腺癌外周血中CD4-CD8- T细胞的含量为(6.11%±1.40%)，显著高于手术前胰腺癌外周血中CD4-CD8- T细胞的含量（P<0.01）；术后胰腺癌患者外周血IL-4含量较术前明显降低（P<0.01），IFN-γ含量较术前则明显增高（P<0.01），进一步研究发现术前胰腺癌患者CD4-CD8- T细胞的比例与IL-4含量呈负相关（r=－0.627，P<0.01）。IFN-γ与IL-4分别为Th1细胞因子和Th2细胞因子，胰腺癌患者中IFN-γ含量减少，IL-4含量增高表明机体内发生了Th1细胞因子向Th2型细胞因子偏移，影响患者机体免疫功能，以利于肿瘤细胞发生免疫逃避，我们的研究显示胰腺癌患者术后IFN-γ含量增高，多数研究表明CD4-CD8- T细胞可分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子[8-10]，术后IFN-γ含量增高可能与术后CD4-CD8- T细胞比例上升使分泌的IFN-γ增多有关，而IL-4含量降低可能与术后CD4-CD8- T细胞比例上升使其对CD4＋ T细胞抑制作用增加使其分泌减少有关。IL-4含量下降、IFN-γ含量上升可纠正Th1细胞因子向Th2型细胞因子偏移，调整机体的免疫状态，增强机体抗肿瘤的能力。但是机体的免疫状态并不是通过一次检测IL-4、IFN-γ等细胞因子的水平以及CD4-CD8- T细胞比例就能反映出来，而且不同的检测方法可能影响对结果的判断，因此需要结合其他的一些临床指标来综合判断胰腺癌患者的手术前后免疫功能的变化。我们的研究表明术后胰腺癌患者CD4-CD8- T细胞含量增加、IL-4含量下降、IFN-γ含量上升，CD4-CD8- T细胞比例的变化能影响IL-4、IFN-γ含量的变化，胰腺癌患者手术前后测定CD4-CD8- T细胞比例、IL-4、IFN-γ含量对预测机体的免疫水平具有一定的参考价值。
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