胃泌素和胆囊收缩素对胆管癌细胞浸润和转移的影响
发表时间：2009-07-01 浏览次数：776次
作者：张罕松 王曙光 聂洪峰
【关键词】 胃泌素
【摘要】目的 观察胃泌素（gastrin）及胆囊收缩素（CCK）对胆管癌细胞浸润转移的影响。方法 用Transwell小室分析胃泌素及胆囊收缩素对胆管癌细胞浸润转移能力的影响。并用RT-PCR及Western blot分析经胃泌素及胆囊收缩素刺激后，胆管癌细胞QBC939浸润转移相关分子基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达。结果 经胃泌素及CCK作用后，胆管癌细胞浸润转移能力明显增强，可能与浸润转移相关分子MMP-2、MMP-9表达增多有关。而其受体抑制剂丙谷胺（proglumid）可抑制该作用。结论 胃泌素和胆囊收缩素可促进胆管癌细胞浸润和转移，而丙谷胺可抑制该作用。
【关键词】 胆管癌; 胃泌素; 胆囊收缩素
Effects of gastrin and CCK on the invasion and metastasis of the bile duct carcinomaZhang Hansong， Wang Shuguang， Nie Hongfeng. Institute of Hepatobiliary Surgery & Southwest Hospital， Third Military Medical University， Chongqing 400038， China【Abstract】 ObjectiveTo study the effects of gastrin and cholecystokinin （CCK） on the invasion and metastasis of the bile duct carcinoma. MethodsBile duct cancer cell strain QBC939 was used in this study. A Transwell cell culture chamber assay in vitro was used to detect the ability of invasion and me-tastasis of QBC939 cells. The influence of CCK， gastrin， and proglumide on the protein expression of MMP-2 and MMP-9 was investigated by Western blot. ResultsGastrin and CCK increased the tumor cells' ability of trans-matrigel， and enhanced the protein expression of MMP-2 and MMP-9. The antago-nist of the CCK and gastrin receptors， proglumide， inhibited their effects on the enhancement of both the expression of the MMP-2 and MMP-9 and the adhesion of bile duct cancer cells to the matrigel. Conclusions Gastrin and CCK can enhance the invasion and metastasis of the bile duct cancer cell through the gastrin/CCK receptor pathway. This effect may be related to the up-regulated expression of MMP-2 and MMP-9.
【Key words】bile duct cancer; gastrin; cholecystokinin
胃泌素（gastrin）及胆囊收缩素（cholecystoki-nin，CCK）等胃肠激素是哺乳动物神经内分泌细胞分泌的肽类激素。大量的研究证实，胃泌素及胆囊收缩素能促进一些消化系肿瘤的发生、演进。一些临床证据和动物实验显示，其对肿瘤的浸润和转移也有显著的促进作用，但关于具体机制的研究还相当缺乏。因此，对胆管癌浸润和转移防治的研究，是胆管癌综合治疗重要内容。研究显示，大部分胆管癌细胞都存在着Gastrin/CCK受体的表达，而其与胆管癌细胞浸润和转移的关系，据笔者检索尚未见有相关报导。本实验拟通过多种方法，探讨胃作者单位: 400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南肝胆外科医院 泌素与胆囊收缩素胆管癌浸润和转移的联系，希望找出抑制胆管癌浸润转移新的治疗措施。
1 材料与方法
1.1主要试剂及来源五肽胃泌素，由上海丽珠东方生物制药公司提供。CK8肽、丙谷胺（proglumid）、Matrigel胶，购自Sigma公司。Transwell小室购自Costar公司。 DAB显色试剂盒购自博士德生物技术公司。RT-PCR 试剂盒购自Promega，PVDF膜购自美国Sigma公司。Tripure isolation reagent购自Roche公司。
1.2人胆管癌QBC939细胞株为第三军医大学全军肝胆外科研究所王曙光教授 建株并提供。QBC939 10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基5～6 ml于37 ℃，CO2 的体积分数为5%培养箱中培养。一般3～4代传1次。实验采用对数生长期细胞，消化传代后，在小牛血清的质量分数为10%的DMEM培养基中培养贴壁，再换成无血清培养液，体外无血清培养的胆管癌细胞分别加入各药品终浓度为1×10-6mol/L的胃泌素、CCK及丙谷胺。 1.3 检测指标及方法
1.3.1Transwell小室检测胆管癌细胞的体外侵袭力取对数生长期QBC939细胞用 0.25%胰酶消化后，用无血清DMEM培养液洗涤3次，制成单细胞悬液，台盼蓝染色确定细胞成活率，分别用无血清DMEM培养基（对照组）及含1×10-6mol/L的胃泌素（组）、CCK（组）、胃泌素+丙谷胺（组）及CCK+丙谷胺（组）的培养液稀释至5×104 /ml，振荡混匀，备用。将25 μl 1 mg/ml 的Ma-trigel胶分3次均匀涂于Transwell小室的微孔膜上，每次间隔10 min，紫光灯下放置30 min使其胶化。取1室，加入考马斯亮蓝检查有无渗漏。将上述制备的各组细胞悬液75 μl， 分别加入 Transwell 小室中，置入含成纤维细胞培养上清的24孔培养板中，每组设3复孔，置入培养箱中培养24 h。擦去小室内侧Matrigel胶及细胞，取下Transwell微孔滤膜在多聚甲醛液的质量分数为5%中固定30 min，常规HE染色。400倍光镜下观光察，随机取5个高倍视野，计数透过膜细胞数。 1.3.2Western blot检测胃泌素及胆囊收缩素及其受体拮抗剂丙谷胺处理后胆管癌细胞基质金属 蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）表达分组情况及细胞准备同前。收集待测细胞样本，用细胞裂解液充分裂解抽提后，采用Low-ry法蛋白定量。调整各组蛋白浓度，使得样品终浓度为5 mg/ml。置于10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳数小时，电转移至PVDF膜上，加上特异性抗体孵育4℃过夜（约12 h）。将膜与HRP标记的第二抗体孵育37 ℃ 2h。经DAB显色后，扫描后于Mias图象分析系统中分析，蛋白含量以Volume值表示 （Volume: D（λ）×mm2 ）。
2 结果
2.1侵袭小室实验结果每个小室随机抽取5个视野，计算每个视野的细胞总数。结果发现，经胃泌素及胆囊收缩素刺激后，胆管癌细胞穿过Matrigel胶的细胞数明显高于对照组（ P <0.05），而加用丙谷胺后，穿过的细胞数比胃泌素及胆囊收缩素组明显降低，与对照组比较差异无统计学意义（ P > 0.05） 。这提示在经胃泌素与胆囊收缩素刺激后，胆管癌细胞的体外侵袭力升高，结果见表1。 2.2Western blot检测胆管癌细胞MMP-2及MMP-9的表达运用Mias软件分析各条带的积分光密度值，发现经胃泌素刺激后，胆管癌细胞合成MMP-2及MMP-9增加明显，与对照组比较差异有统计学意义（ P < 0.05） ，而丙谷胺可抑制该作用，说明胃泌素和胆囊收缩素可以促进MMP-2及MMP-9的生物合成，见图1、2及表2。表1 各组间穿过Matrigel胶的细胞数量比较对照胃泌素胃泌素+丙谷胺CCKCCK+丙谷胺计数16.07±13.8328.40±13.57a 17.53±15.77b 34.47±30.60a 21.00±9.69b a: P <0.05，与对照组比较;b: P <0.05，与前一组比较。图1 各组间MMP-2蛋白的表达1:对照;2:胃泌素;3:胃泌素+丙谷胺;4:CCK;5:CCK+丙谷胺 图2 各组间MMP-9蛋白的表达1:对照;2:胃泌素;3:胃泌素+丙谷胺;4:CCK;5:CCK+丙谷胺表2 各组间MMP-2和MMP-9蛋白的表达（Volume×10 5 ）对照胃泌素胃泌素+丙谷胺CCKCCK+丙谷胺 Volume（MMP-2）1.27±0.182.40±0.33a 1.31±0.29b 2.82±0.39a 1.75±0.21abVolume（MMP-9）0.62±0.071.06±0.11a 0.48±0.02b 0.95±0.09a 0.73±0.04b a: P <0.05，与对照组比较;b: P <0.05，与前一组比较。
3 讨论
胆管癌细胞株QBC939是国内惟一建株的胆管癌细胞株［1］。国内的研究表明，胆管癌细胞也有Gastrin/CCK受体的表达，而且胃泌素及胆囊收缩素对胆管癌的增殖有明显的促进作用［2-3］。由此我们推测胃泌素及胆囊收缩素在胆管癌细胞的浸润和转移中也有一定的作用。本实验以QBC939细胞为研究对象，体外观察胃泌素与胆囊收缩素及其拮抗剂丙谷胺对其浸润和转移的影响。并主要从基质降解能力探讨胃泌素和胆囊收缩素对胆管癌细胞浸润转移的影响。其重要意义主要表现在3个方面:（1）分解健康组织使肿瘤增生;（2）破坏肿瘤周围的间质成分及各种物理屏障，促进肿瘤的转移;（3）破坏间质的同时，有助于为新生血管提供生长空间，同时间接的促进了肿瘤经血转移［4］。本实验首先用侵袭小室法检测了胆管癌细胞的体外侵袭力。Albini［5］建立的侵袭小室是体外检测肿瘤细胞侵袭力和筛选高转移细胞的经典方法，在体外较理想地模拟了侵袭的模式，故较多地被应用于侵袭机制的研究。其结果综合反映了肿瘤细胞对细胞外基质的降解能力。通过侵袭小室的结果我们证实胃泌素及胆囊收缩素可促进胆管癌细胞穿过Matrigel胶向下室转移。本实验还进一步检测了胃泌素和胆囊收缩素对QBC939细胞外基质降解酶类MMP-2及MMP-9表达的影响，细胞基质金属蛋白酶类是一大类金属离子依赖性酶类的合称，是重要的基质降解酶类，在肿瘤的生长、浸润和转移过程中起着重要作用，而在所有的细胞基质蛋白酶中分布较广，与肿瘤转移和浸润关系较密切的主要是MMP-2及MMP-9［6］，经Western blot，我们证实了经胃泌素或胆囊收缩素刺激后，MMP-2及MMP-9的表达量均有明显的增加，直接证实了胃泌素及胆囊收缩素对胆管癌基质降解能力有促进作用。丙谷胺是最早发现的胃泌素及胆囊收缩素的受体拮抗剂，由于其空间结构与胃泌素及胆囊 收缩素C-末端的空间结构类似，可竞争性的与CCK受体相结合，从而抑制胃泌素及胆囊收缩素所引起的各项生理作用［7］。在本实验中，我们发现丙谷胺可以对抗胃泌素、胆囊收缩素，对胆管癌细胞基质有降解作用，提示其可能对胆管癌的浸润和转移过程有抑制作用，这主要是阻断胃泌素和胆囊收缩素的作用而实现的。作为一种抑酸剂，丙谷胺在临床已使用多年，现今对其与肿瘤关系的研究，揭示出它在临床上有更广泛的应用前景。而且，现今已经开发的很多gastrin/CCK受体拮抗剂，很多都是由丙谷胺衍生而来，其作用是丙谷胺百多倍，在一些动物实验和临床研究中，显示出对肿瘤生长和转移有明显的抑制作用。这些受体拮抗剂的出现，使gastrin/CCK受体为靶向的治疗策略有了更多的选择。
参考文献
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