胆道梗阻解除术后肾水通道蛋白2表达变化的实验研究

作者：孟相真    作者单位：中国医科大学附属盛京医院 第二微创胆道外科，辽宁 沈阳 110004       【摘要】  明确水通道蛋白2(aquaporin 2 protein，AQP2)在梗阻性黄疸梗阻解除术后大鼠肾脏的表达情况。方法 采用蛋白质印迹（western blotting）法及RT?鄄PCR方法检测在梗阻性黄疸梗阻解除后不同时间的大鼠肾脏AQP2及其mRNA的水平。结果 AQP2蛋白水平在0 h，24 h，72 h随时间推移逐渐降低，1周时明显高于解除梗阻0 h的水平，但所有实验组均较正常对照组（假手术组）低（P<0.05）。而AQP2的mRNA水平在梗阻性黄疸梗阻解除后0 h，24 h，72 h随时间推移逐渐性升高，1周时回落，但比0 h水平还要高，然而所有实验组均较正常对照组（假手术组）高（P<0.05）。结论 梗阻性黄疸梗阻解除术后肾功能在早期受损逐渐加重， AQP2蛋白水平下调，而AQP2基因水平上调。1周时这些结果仍未恢复正常。AQP2在梗阻性黄疸梗阻解除术后肾功能的变化上可能起到了重要的作用。

      【关键词】  水通道蛋白2 黄疸 阻塞性 肾功能 大鼠

      An experimental research of the changes of AQP2 expression after relieving of the obstruction of the biliary tract    MENG Xiangzhen*， LIU Jingang*， WANG Yong， et al. * Department of the Second Minimal Invasive Biliary Tract Surgery， Shengjing Affiliated Hospital of China Medical University， Shenyang 110004

      Abstract   Objective  To study the expression of aquaporin 2 protein (AQP2) in the kidney after relieving of the obstruction of the biliary tract. Methods  Western blotting and RT?鄄PCR were used to determine the protein and mRNA level of AQP2 in different time after the relieving of the obstruction of the obstructive jaundice. Results  Within 72 hours of post?鄄released obstructive jaundice， the mRNA level of AQP2 was increased gradually， while its protein level was gradually decreased with the progress of duration at 0 hour， 24 and 72 hours. One week after release， the mRNA level was decreased but still higher than that of 0?鄄hour group. Correspondingly， the protein level was increased and even higher than that of 0?鄄hour group. The protein level of all treated groups was lower than that of normal group (false operation group)， in contrast， the mRNA level was higher. Conclusion  The study implies that in the first few days of post?鄄released obstructive jaundice model in rats， the renal function becomes worse gradually， with protein and mRNA level of AQP2 decreased and increased respectively. They do not recover during one week. It implies that AQP2 may play a great role in the recovery of the renal function of post?鄄released obstructive jaundice model in rats.

      Key words   aquaporin 2 protein； jaundice， obstructive； renal function； rats 临床上约有60%～70%梗阻性黄疸患者术后发生肾小球滤过率下降，急性肾功能衰竭的总发生率为4%～18%，而一旦发生急性肾功能衰竭，其病死率高达50%～76%[1-2]。Fogarty等[3]回顾1960～1994年的文献报道中发现， 在2 164例梗阻性黄疸患者中术后急性肾功能衰竭的发生率及病死率一直无明显下降。目前梗阻性黄疸梗阻解除术后引发的肾功能衰竭机制还不是十分清楚，预防术后并发急性肾功能衰竭还没有有效的方法。根据近期文献报道，AQP2——一种肾脏集合管结构蛋白，在药物、缺血引起的急性肾功能衰竭中表达明显下调[4]，这一发现对于肾功能损伤的早期诊断具有一定价值。本研究探讨了梗阻性黄疸胆道再通术后肾水通道蛋白2蛋白、基因表达水平的变化，对于明确围手术期肾集合管损伤规律具有一定的价值。

      1  材料和方法

      1.1  主要试剂和仪器

      1.1.1  试剂  抗AQP2（单克隆）抗体购自武汉博士德公司，二抗购自Sigma公司，电泳用丙烯酰胺、琼脂糖、Tris及甘氨酸等购自上海生物工程公司，大鼠AQP2水通道基因扩增引物序列（序列号：      NM?鄄012909?鄄275?鄄503）（上海细胞生物所合成）为：AQP2?鄄F：5′?鄄GCATCGGCATCCTGGTTC?鄄3′；AQP2?鄄R：5′?鄄CTGTGGCGTTGTTGTGG?鄄3′，β?鄄actin?鄄F：5′?鄄CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC?鄄3′；β?鄄actin?鄄R：5′?鄄CCAACAGATGACTTGCGCTCAGG?鄄3′，提取总RNA的TRIZOL试剂购自美国Promega公司，RT?鄄PCR试剂盒及酶均购自TaKaRa公司。

      1.1.2  仪器  超速低温离心机：美国产DU PONT —SORVALL SUPER—T21型，PCR扩增仪：美国产PTC?鄄200TM型，电泳仪：美国产BIO?鄄RAD—PAC300型，电泳槽：大连产捷迈 HM?鄄I型水平电泳槽，凝胶成像分析系统：上海天能公司产GIS?鄄2020型凝胶扫描成像系统，超速低温离心机：德国产Heraus?鄄Biofuge?鄄PrimoR型，紫外分光光度计：岛津UV?鄄260型（日本），组织超声匀浆器：UP200H型（德国），电泳仪：美国产BIO?鄄RAD—PAC300型，垂直电泳槽：美国产BIO?鄄RAD MiniPROTEAN Ⅱ cell型，转印电泳槽： Tanon小型（上海天能公司）。

      1.2  实验分组及过程  雄性Wistar大鼠50只，4周龄、质量250～300 g（购于盛京医院实验动物中心）， 将50只大鼠随机分为5组，每组10只。实验前常规检疫1周，未发现疾病者列入实验组。其中4组制作梗阻模型（具体制作方法见后文），另一组制作为假手术组。梗阻1周后解除，并分别于解除梗阻的同时，24 h后，72 h后，1周后分别处死一组取材，同时处死假手术组取材。无菌条件下取腔静脉血5～8 ml，置于真空采血管内，静置15 min，离心   （4 000 r/min，10 min），取上清置于子弹头内冻于  -20℃冰箱内以待检测各项生化指标（采用全自动生化分析仪检测）。将大鼠左侧肾脏置于大子弹头内冻于液氮罐内转运至-80℃冰箱内，以备进行western blotting法检测AQP2的蛋白表达及RT?鄄PCR检测AQP2的mRNA表达水平。

      1.3  梗阻黄疸模型制备及解除梗阻方法  首先，称量大鼠质量、按照0.3 ml/100 g的计量肌肉注射10%水合氯醛。待麻醉成功后将鼠固定于工作台上。剑突下1 cm备皮，约 2 cm长正中切口进入，锐性分开腹直肌、进入腹腔。进腹后将肝缘用棉签推开即可暴露胆总管，用1根7?鄄0丝线穿过胆总管后不结扎，两线端分别通过圆针在腹直肌外缘距中线约1～2 cm处穿过肌层后用2 mm外径硅胶管作为垫片固定于导管上，力度适中，以导管产生轻度形变为准，两针间距约0.5 cm，线结在皮下。梗阻1周后解除，解除梗阻时仅需要皮下开口，找到导管，并切断丝线，取出导管即可。正常组即假手术组，仅做开腹关腹。

      1.4  蛋白质印迹法(western blotting)  组织标本用生理盐水冲净后剪碎，加入6倍体积的细胞裂解液A（2 mM EDTA，2 mM EGTA，3.48% PMSF，8%蔗糖，20 mM Tris /HCl，pH7.5）匀浆，离心（1 7500 r/min×1.5 h，4℃），上清为胞浆蛋白样品。沉淀（膜的成分）加入1 ml细胞裂解液B（1% TritonX?鄄100，   5 mM EGTA，2mM EDTA）在冰水中匀浆，超声粉碎20 s，间隔20 s，2～3次，4℃静置过夜后，离心    （1 7500 r/min×1.5 h，4℃），取上清为胞膜蛋白样品。Lorry法蛋白定量并调节蛋白浓度至10 μg/μl，取样品进行12% SDS?鄄PAGE 分析，电泳结束后进行转印（海绵—滤纸—NC膜—凝胶—滤纸—海绵），100伏电压转移 40到50 min。NC膜在1×TBS中浸泡10 min，封闭1 h，1×TTBS洗膜2次，每次5 min，NC膜在一抗溶液中浸泡过夜（4℃）。NC膜从一抗溶液中取出，用1×TBS快速洗1次，用1×TTBS洗膜2次，每次5 min，NC膜转到二抗溶液中浸泡2 h（室温），1×TTBS洗膜2次，每次5 min，1×TBS洗膜5 min，染色至条带呈现，终止染色。NC膜在滤纸中干燥保存，用GIS?鄄2020凝胶图像分析系统扫描分析结果。

      1.5  RT?鄄PCR  总RNA提取：用TRIZOL总RNA提取试剂按说明书操作。具体步骤如下：组织从-80℃冰箱取出，每份样品用1 ml TRIZOL试剂匀浆，加入200 μl氯仿快速振摇15 s，室温放置5 min，离心（1 2000 r/min×15 min，4℃，取上清加入异丙醇500 μl，混匀，置4℃冰箱内1 h沉淀RNA。离心 （1 2000 r/min×10 min，4℃），弃上清后RNA沉淀经75%乙醇洗1次，离心（7 500 r/min×5 min，4℃）。RNA沉淀用适量无RNase水溶解。取少量总RNA用紫外分光光度计测260 nm及280 nm的吸光度值，检测提取RNA的质量及产量。将RNA稀释成1 μg/μl浓度，-80℃保存备用，反转录合成cDNA后进行PCR扩增。以2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。数据分析：用GIS?鄄2020凝胶扫描成像分析系统扫描各扩增产物，以GAPDH吸光度值标化目的产物吸光度值，得到目的产物相对含量。

      1.6  统计学方法  所有记量数据均采用x±s表示，统计学处理采用SPSS 11.5软件包处理，Oneway ANOVA 法方差分析，差异显著性标准为Ｐ<0.05；数据均满足正态分布，经方差齐性检验后入选。

      2  结果

      2.1  实验动物结果  动物在梗阻模型建立过程中死亡2只，后经及时补齐；在解除梗阻过程未有死亡，假手术组无死亡。

      2.2  生化检测结果  见表1。结果说明：总胆红素、直接胆红素、转氨酶在梗阻性黄疸梗阻解除后0 h，24 h，72 h，1周随时间推移逐渐下降（P<0.05）；尿素在梗阻性黄疸梗阻解除后24 h比0 h升高（P<0.05），72 h基本恢复至解除梗阻0 h的水平（P>0.05），1周时比0 h进一步下降（P<0.05），但仍较假手术组高（P<0.05）。同时也说明梗阻模型建立成功，解除梗阻有效，梗阻已经引起临床肾功能损害。

      2.3  AQP2的蛋白表达结果  见图1。AQP2平均密度的各组值见表2。结果说明，结合蛋白印迹图示及统计学分析得出AQP2蛋白的水平在0 h，24 h， 72 h随时间推移逐渐降低（P<0.05）， 然而到1周时AQP2蛋白的水平已经明显高于解除梗阻0 h水平（P<0.05）。但所有组中假手术组AQP2蛋白的水平最高（P<0.05）。

      2.4  AQP2的mRNA 结果  见图2。AQP2/β?鄄actin的各组值见表3。结果说明：结合电泳图像和凝胶扫描成像系统分析的相对值以及最终统计学分析得出AQP2的mRNA表达水平在梗阻性黄疸梗阻解除后0 h，24 h，72 h随时间推移逐渐性升高（P<0.05），   1周时回落，但比0 h水平还要偏高(P<0.05)。但所有组中AQP2的mRNA水平以假手术组最低（P<0.05）。

      3  讨论

      水的跨膜转运对维持细胞正常代谢具有重要作用，所有组织细胞都允许水以简单扩散方式通过细胞膜，但某些细胞如红细胞、肾近曲小管上皮细胞等对水的通透性很高，不能以水穿越脂质双分子层弥散来解释。14年前调节水代谢的水通道蛋白被发现这一现象才得以解释，至今为止已发现AQP0~ AQP10共11种水通道蛋白[5]。AQP2是1993年被确认的水通道蛋白家族中的一种，位于肾集合管主细胞管腔侧和靠近管腔侧的囊泡内，是调节肾脏集合管对水通透性的主要水通道蛋白，在调节肾脏水平衡中起重要作用。约有10%的肾小球滤过液流经集合管时是在AQP2的参与下被重吸收的[6?鄄7]，而且Landon等[4]通过实验发现AQP2的表达异常减少与肾功能损伤关系密切。近期有大量文献报道，药物、缺血引起的急性肾功能衰竭中水通道蛋白2表达明显下调[4]。这些发现使通过水通道蛋白变化探讨肾功能损伤的研究成为可能。

      此外，现已发现AQP2是一种对抗利尿激素敏感的水通道。锂剂可以抑制它的表达，由此可以解释锂剂的毒副作用。AQP2在肾浓缩机制中起作用，在加压素(vasopressin，AVP) 作用下通过两条途径调节集合管对水的通透性[8?鄄9]。首先加压素对含有AQP2的载体从细胞内向管腔膜转运有影响， 使集合管主细胞膜AQP2 数量在短时间内迅速增加，主细胞膜对水的通透性增大。其次，加压素可长期刺激主细胞的AQP2合成，从而增大主细胞的转运能力。

      以上研究说明了AQP2在调节肾脏水代谢中起到了重要作用，但是具体在梗阻性黄疸导致的肾脏损害中是否起到了同样重要的作用及如何起作用均未见进一步报道。本实验通过研究AQP2蛋白及基因水平在梗阻性黄疸梗阻解除过程中在肾脏中的表达变化情况，来探讨AQP2在梗阻性黄疸导致的肾脏损害中可能起到的作用。首先本试验成功建立了梗阻黄疸模型，通过总胆红素、直接胆红素、转氨酶这些生化结果随时间推移逐渐降低可以证明此模型制作成功，同时也说明解除梗阻有效。

      结合本实验结果，不难发现大鼠肾脏的功能在梗阻性黄疸梗阻解除术后早期受损逐渐加重，72 h左右逐渐恢复，这一现象与临床中梗阻性黄疸手术后1周内肾功能损害最为严重的情况有类似之处[2]。在此期间AQP2蛋白表达水平逐渐降低，术后第  72 h表达较术后早期及1周时明显降低，此期间内相对应的AQP2的基因表达水平逐渐升高，但1周时仍未完全恢复正常水平。目前针对梗阻性黄疸胆道再通术后水通道蛋白2表达变化的研究国内外尚未见相关报道，对于以上结果尚缺乏足够的证据和相关研究来明确解释。结合近期文献报道，缺血、药物造成的肾功能衰竭中，AQP2表达明显下调[4，10]。经前期研究已发现，梗阻性黄疸中一氧化氮[11-12]、胆红素[13]、TNF?鄄α、内毒素[14-16]等细胞因子血内浓度明显增加[13]，解除梗阻早期这种损伤进行性加重。对于AQP2mRNA表达在解除梗阻后表达上调，与AQP2蛋白表达不一致，目前认为有以下几个主要原因：首先，AQP2是定位在肾集合管主细胞顶质膜的一种膜蛋白，在梗阻时比较容易受到来自于管腔的损伤。而AQP2mRNA主要在主细胞粗面型内质网表达，由于此时肾脏损伤仍然处于早期阶段，集合管细胞损伤不重。因此，出现AQP2mRNA与AQP2蛋白表达不一致现象。另外，也可能与蛋白质短期、长期调节机制有关。上述各种可能因素可能对含有AQP2的载体从管腔膜向细胞内转运有影响，使集合管主细胞膜AQP2数量在短时间内迅速减少，主细胞膜对水的通透性降低。上述各种因素也可能通过长期刺激抑制AQP2的mRNA翻译成AQP2进而减少主细胞的AQP2合成，从而降低主细胞的转运能力，而在基因水平并没有上述损伤改变，有可能通过负反馈机制引起基因表达增强，这点需要进一步实验证实。

      总之，本实验成功建立了梗阻性黄疸梗阻和解除的模型，发现梗阻性黄疸梗阻解除术后肾功能在早期受损逐渐加重；同时发现了梗阻性黄疸梗阻解除术后早期AQP2蛋白水平下调，而同期AQP2基因水平上调，为进一步研究治疗梗阻性黄疸术后肾功能早期的变化打下基础。

【参考文献】[1] 何三光. 梗阻性黄疸减黄的利弊[J]. 中国实用外科杂志，1996，16（1）：11-13.

[2] 胡铭荣，徐德征. 内毒素血症与梗阻性黄疸病人肾功能损害的关系[J]. 肝胆胰外科杂志，2002，14(2)：107-109.

[3] Fogarty BJ， Parks RW. Renal dysfunction in obstructive jaundice[J]. Br J Surg，1995，82(7)：877-889.

[4] Landon S. King， David Kozono， Peter Agre. From structure to disease：The evolving tale of aquaporin biology[J]. Nature reviews Molecular Cell，Biology，2004，9(5)：687-198.

[5] 郭宏骞，孙则禹，辛殿旗，等. 水通道蛋白及其ｍＲＮＡ在正常大鼠肾脏的表达[J]. 镇江医学院学报，2000，10（4）：632-633.

[6] 蒋飞照，陈哲京，张启瑜. 梗阻性黄疸并发急性肾功能损害相关因素分析[J]. 肝胆胰外科杂志，2002，14(1)：40-42.

[7] 张丰深，何振平. 肾内血管活化性物质与梗阻性黄疸肾损害[J]. 国外医学·外科学分册，1999，26（1）：20-22.

[8] 刘彦华，才丽平. 肾脏AQP2 表达及穿梭调节的分子机制[J]. 国外医学·生理病理科学与临床分册，2004，24(5)：463?鄄466.

[9] 戴东，谭小宇，曾宪成，等. 梗阻性黄疸围手术期急性肾功能衰竭的预防[J]. 中国普通外科杂志，2002，11(8)：473-475.

[10] 唐庆娟，刘声远. 水通道蛋白家族成员ＡＱＰ2的研究进展[J]. 国外医学·生理病理科学与临床分册，2001，21(3)：238-240.

[11] 王勇，陈卫民，高林林. 多巴胺调控实验性梗阻性黄疸围手术期肾髓质水通道蛋白2表达[J]. 世界华人消化杂志，2007，15(25)： 2714-2717.

[12] Sheen?鄄Chen SM， Chen HS， Ho HT， et al. Effect of bile acid replacement on endotoxin?鄄induceed tumor necrosis factor?鄄α production in obstructive jaundice[J]. World J Surg，2002，26(4)：448-450.

[13] Kimmings AN， van Deventer SH， Obertop H， et al. Endotoxin， cytokines， and endotoxin binding proteins in obstructive jaundice and after preoperative biliary drainage[J]. Gut，2000，46(5)：725-731.

[14] 刘金钢，王勇，宋军，等. 生长激素对实验性梗阻性黄疸大鼠内毒素血症的防治[J]. 中华普通外科杂志，2001，16(8)：493-494.

[15] 张丰深，何振平，段恒春. 梗阻性黄疸并发肾功能损害的实验研究[J]. 第三军医大学学报，2002，24(9)：1046-1047.