急性脑梗死患者蛋白S基因多态性和血浆蛋白Ｓ水平与其家族史关系的研究

　　作者：牛琦,杨期东,张乐,夏健　　作者单位：南京医科大学第一附属医院神经科

　　【摘要】 目的 探讨急性脑梗死(ACI)患者蛋白S基因(PROS1)多态性和血浆总蛋白S(tPS)和游离蛋白S(fPS)水平与其家族史的关系。方法 对93例ACI患者，其中散发(NFCI)组83例，有家族史(FCI)组10例，采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性分析法(PCRRLFP)检测PROS1 A2148G多态性;采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)测定血浆tPS和fPS水平;并与正常对照组进行比较。结果 ACI组PROS1 A2148G的AA、AG和GG型频率分别为18.3%、48.4%和33.3%，与正常对照组(22.0%、48.0%和30.0%)差异无统计学意义(均P>0.05)。FCI组A2148G GG基因型频率(50%)高于正常对照组(30%),但差异无统计学意义(P>0.05)。ACI组GG基因型患者血浆tPS水平和fPS水平[(13.67±1.49)、(6.07±0.61)μg/ml]显著低于AA型和AG型[(15.73±1.24)、(6.72±0.55)和(15.15±1.48)、(6.63±0.66)μg/ml](均P<0.01)，且FCI组血浆fPS水平[(6.12±0.69)μg/ml]显著低于NFCI组[(6.48±0.75)μg/ml](P<0.05)。结论 PROS1 A2148G GG基因型导致FCI患者血浆fPS水平降低，其基因型可能与ACI家族史有关。

　　【关键词】 急性脑梗死,家族史,蛋白S,基因多态性

　　Abstract：Objective To study the association between polymorphism of protein S gene(PROS1) and plasma levels of total protein S (tPS),free protein S (fPS) and its family histroy in patients with acute cerebral infarction(ACI). Methods 93 patients with ACI, including 83 sporadic forms(NFCI group)and 10 with family history(FCI group) were examined by PCRRFLP to detect the PROS1 A2148G polymorphism. The plasma levels of tPS and fPS were tested by ELISA method. The data were compared with normal control group. Results The frequencies of AA, AG, GG genotype of A2148G in ACI group were 18.3%, 48.4% and 33.3% respectively, had no significantly difference with those in normal control group(22.0%, 48.0% and 30.0%)(all P>0.05). The frequency of GG genotype in FCI group(50.0%)was higher than that in normal control group(30.0%), but had no significantly difference(P>0.05).The plasma levels of tPS and fPS in patients with GG genotype [(13.67±1.4 9) and 6.07±0.61)μg/ml] were lower than those in patients with AA and AG genotypes [(15.73±1.24),(6.72±0.55)and(15.15±1.48),(6.63±0.66)μg/ml](all P<0.01). The plasma levels of fPS in the FCI group[( 6.12±0.69)μg/ml] was lower than that in the NFCI group [(6.48±0.75)μg/ml](P<0.05).Conclusions GG genotype of PROS1 A2148G lead to the lower plasma level of fPS in patients with FCI. GG genotype of A2148G may be associated with susceptibility of ACI family history.

　　Key words：acute cerebral infarction; family history; protein S; gene polymorphism

　　近年来流行病学研究和动物实验[1,2]高度提示急性脑梗死(ACI)的发病机制与遗传有关。在ACI的危险因素中，凝血机制紊乱受遗传因素影响较大。目前已发现了十余种可能与ACI有关的凝血系统基因多态性[3,4]，部分已得到证实。蛋白S(PS)是抗凝血过程的关键因子，只有游离型PS(fPS)才能作为活化蛋白C(APC)的辅助因子发挥抗凝作用。各种原因引起的PS异常可导致动静脉血栓。LeroyMatheron等[5]研究发现PS基因 (PROS1)15号外显子编码区的2148碱基A→G突变(Pro 626 CCA/CCG)是PROS1的常见多态性，参与正常血浆PS水平的调节。本研究分析此多态位点各基因型在散发性ACI(NFCI)患者和有家族史ACI(FCI)患者中的分布及其与血浆PS水平的关系，旨在探讨PROS1多态性与ACI家族史的关系。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 (1)ACI组：系2001～2003年湘雅医院收治的93例ACI患者，均来自湖南长沙地区，汉族;男61例，女32 例;年龄24～87岁，平均(60.7±11.7)岁;病程4～48 h，平均(31.0±4.1)h。均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准，并经CT和/或MRI确诊; 均无口服抗凝剂、避孕药者,无肝病、肾病综合征、糖尿病、弥散性血管内凝血、妊娠及其他部位血栓病史者。根据有无家族史分为无ACI家族史组(NFCI组, 83例)和FCI组(10例)。(2)正常对照组：系100名无血缘关系的健康体检者，均来自湖南长沙地区，汉族，其中男61人，女 39人;年龄25～74岁，平均(57.3±12.0)岁。ACI组与正常对照组性别、年龄匹配。

　　1.2 方法

　　1.2.1 基因组DNA样品制备 采受试者静脉血4.5 ml，置含0.5 ml 0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝试管。用常规酚和氯仿抽提法提取DNA。

　　1.2.2 PROS1多态性检测 用于扩增PROS1 15号外显子上A2148G多态位点的引物序列[5]：上游5′CAAGATGCTAAAAGTCTTGG3′;下游：5′GAAACATAAGTATAATTACAC3′。扩增片段长度为267 bp，经PCRDESN软件验证，并在GCG软件作Blast确定其特异性高后由上海Songon公司合成。PCR扩增反应体系： 基因组DNA 100 ng，dNTPs 10 mmol/L 1.0 μl，上、下游引物各5 pmol/L，Taq酶2 U，ddH2O 14.6 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，进行30次循环，最后延伸7 min。反应完毕后用2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5 μg/ml EB)检测扩增产物。扩增产物使用限制性内切酶BstⅪ酶切，酶切后用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法检测酶切产物。GG型不被酶切，AA型可被酶切为177 bp和90 bp两个片段，AG杂合子则出现267 bp、177 bp和90 bp 3个片段。

　　1.2.3 血浆tPS和fPS水平测定 ACI组患者于入院次日，正常对照组于体检日清晨空腹采静脉血4.5 ml，置含0.5 ml 0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝试管，30 min内处理。采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)测定血浆tPS和fPS水平，试剂盒购自上海太阳生物技术公司，按说明书操作。

　　1.2.4 统计学方法 基因型频率和等位基因频率的差异用χ2检验或有关校正方法，并按HardyWeinberg平衡法检验样本的群体代表性。血浆tPS和fPS水平采用均数±标准差(±s)表示，不同基因型间血浆tPS和fPS水平比较用ANOVA方差分析法。采用SPSS 10.0软件进行统计学处理。

　　2 结 果

　　2.1 ACI组与正常对照组PROS1 A2148G多态性分布见表1。ACI患者及正常对照组PROS1 15号外显子A2148G的基因型有AA、AG、GG 3种。基因型和等位基因频率分布均符合HardyWeinberg平衡检验(P>0.05)，表明来自同一人群，群体达到遗传平衡。ACI组和正常对照组基因多态性分布频率差异无统计学意义。将NFCI组及FCI组分别与正常对照组比较，FCI组GG基因型频率高于正常对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，NFCI组和正常对照组差异无统计学意义。 表1 ACI组与正常对照组PROS1 A2148G多态性分布组别例数基因型

　　2.2 PROS1 A2148G不同基因型ACI患者血浆tPS和fPS水平的比较 见表2。A2148G AA和AG基因型患者的血浆tPS和fPS水平差异无统计学意义;GG型患者的血浆tPS和fPS水平明显低于AA和AG型(均P<0.01)。表2 PROS1 A2148G各基因型ACI患者血浆tPS 和fPS水平比较注：与AA型和AG型比较*P<0.01

　　2.3 ACI组与正常对照组血浆tPS和fPS水平的比较 见表3。表3 ACI组与正常对照组血浆tPS和fPS水平比较注：与NFCI组比较*P<0.05;与正常对照组比较▲P<0.01

　　ACI组血浆tPS和fPS水平均显著低于正常对照组(均 P<0.01)，其中NFCI组和FCI组血浆tPS和fPS水平均明显低于正常对照组(均P<0.01)，FCI组血浆fPS的水平又明显低于NFCI组(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　研究[6]发现血浆PS水平的变化与ACI的发生和发展有密切关系，在ACI急性期血浆tPS和fPS水平显著降低。血浆PS水平受基因调控和外源性因素双重影响。PROS1突变可导致PS严重缺乏而形成恶性动静脉栓塞，但是十分罕见。正常人血浆tPS和fPS水平在一定范围内波动。位于PROS1 15号外显子A2148G 是其常见的中性多态，在正常人中具有A等位基因者的血浆tPS和fPS水平较高，而G等位基因者则较低[5]。此位点各基因型在ACI患者中的分布及其在ACI发病过程中的作用尚不完全清楚。

　　本研究结果显示FCI组的GG基因型频率高于正常对照组，但差异无统计学意义，可能与样本量较小有关;另将FCI患者家系成员的GG基因型频率与正常对照组比较,发现差异有统计学意义(另文发表)。本研究中GG基因型患者的血浆tPS和fPS水平较其他两种基因型患者低(均P<0.01)，且FCI组的血浆fPS水平较NFCI组低(P<0.05)。上述结果说明，一方面PROS1 A2148G多态性在ACI参与对血浆tPS和fPS水平的调控，G等位基因导致血浆tPS和fPS水平下降更多。但是具体调节机制尚不清楚，有学者[7]推测该位点G等位基因可能产生了一个潜在的剪切位点，致使产生截短mRNA的剪切过程变换，导致PS合成下降，但是迄今未找到截短mRNA的证据;另外一个可能的机制是A2148G多态中G等位基因与其他序列的突变存在不均衡的连锁(可能在启动子区)，但在此区暂未找到其他中性多态。另一方面，FCI组血浆fPS水平低于NFCI组，是由于FCI组中GG基因型分布频率较高所致。研究[8]显示血浆fPS缺乏可导致抗磷脂抗体样血栓形成。另外，在动脉粥样硬化斑块中，受损的血管内皮细胞合成PS的能力下降，导致局部凝血功能紊乱，促进脑梗死发生[9，10]。由此说明 PROS1 A2148G GG基因型分布频率较高可增加ACI发病的遗传易感性，可能为其易感基因之一。Liu等[11]给大脑中动脉闭塞的大鼠注射PS制剂，发现可减少脑水肿体积，减轻缺血再灌注损伤，促进神经功能恢复，提示PS在ACI的急性期具有神经保护作用，且未发现有出血不良反应。据此推测，如果对GG基因型患者外源性增加血浆PS的浓度，有可能预防或减少ACI的发生。

　　需要说明的是，ACI是多种复杂环境因素和多个基因共同作用的结果，每种易感基因在发病过程中所起的作用也有不同，和其他已证实的基因相比PROS1 A2148G在ACI发病作用中的重要性还有待更深入的研究。

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