坎地沙坦治疗大鼠急性胰腺炎的实验研究

坎地沙坦治疗大鼠急性胰腺炎的实验研究作者：李创，郑起，阎钧    作者单位：上海交通大学附属第六人民医院 普外科，上海 200233）    【摘要】  目的 探讨选择性血管紧张素Ⅱ受体亚型AT1拮抗剂坎地沙坦对大鼠急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)的影响。方法 54只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、AP组、AP+坎地沙坦组(每组18只)，腹腔注射20％L-精氨酸溶液建立AP动物模型，坎地沙坦用大鼠灌胃针灌注。各组大鼠分别在造模后第12，24，48小时分批（6只/组/批）心脏取血处死。取胰腺组织观察胰腺病理变化并评分（按Rongione标准），胰腺/体质量比，检测大鼠血清脂肪酶、TNF-α以及IL-10的变化。结果 AP组胰腺炎症评分，胰腺/体质量比，血清脂肪酶、TNF-α、IL-10较对照组明显升高。AP+坎地沙坦组胰腺炎症评分，胰腺/体质量比，血清脂肪酶以及TNF-α较AP组降低。本实验中，应用坎地沙坦对AP大鼠血清IL-10无显著影响。结论 早期应用AT1受体拮抗剂坎地沙坦可以明显减轻大鼠胰腺的急性炎症病变及损伤。    【关键词】  急性胰腺炎；AT1受体拮抗剂；炎症因子；坎地沙坦；大鼠    急性胰腺炎是胰腺最常见的疾病。虽然绝大多数为轻型及自限性，但有1/5可发展为致命的重症胰腺炎[1]。急性胰腺炎的总病死率为5%～10%[2]，如出现并发症则增至35%或更高[3]。肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)是体内一个经典的调节血压和水电解质平衡的系统。近年来研究发现，在胰腺组织中有局部RAS存在。胰腺的RAS有许多非经典RAS成分，影响胰腺的内外分泌功能。急性胰腺炎时，局部RAS被激活，这对胰腺的病理生理改变产生重要影响[4]。据此，本实验将血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂坎地沙坦应用于急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP) 动物模型中，观察其对急性胰腺炎病理过程的影响。1  材料和方法    1．1  材料  L-精氨酸（上海史瑞可生物科技有限公司）溶于生理盐水中配成20％ L-精氨酸；坎地沙坦（日本武田药品工业株式会社）溶于生理盐水分别配成0.2 g/L溶液；血清脂肪酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒（上海复旦中科生物医学科研服务平台）。       1．2  方法  选用健康雄性SD大鼠54只(复旦大学医学院实验动物中心提供)，清洁级，质量250～280 g，清洁级饲养1周后用于实验。实验前禁食不禁水12 h，称质量，随机分为3组，每组18只。①AP 组：腹腔注射20% L-精氨酸2.5 g/kg诱导AP，共2次，间隔1 h；②AP+坎地沙坦组：诱导胰腺炎方式同AP组，造模成功后即予0.2 g/L坎地沙坦溶液灌胃[(2 mg/（kg·d）]；③正常对照组：予腹腔注射同等剂量生理盐水。各组实验大鼠在造模后恢复正常进食，并于第12，24，48小时分3批（6只/组/批）心脏采血处死，血浆离心后-80℃保存待测。小心分离整个胰腺，去除胰腺周围脂肪，称质量，用10%福尔马林固定。    1.2.1  胰腺/体质量比值测定及胰腺病理学检查     计算胰腺/体质量比值，代表胰腺水肿程度。取胰腺体尾部组织，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色。由资深病理科医师盲法对胰腺病理切片观察并按照Rongione等[5]的标准进行组织病理评分，从组织水肿、炎性浸润、细胞坏死、出血4个方面的轻重程度评分。    1．2．2  血清学检测  血清脂肪酶采用酶比色法检测；血清TNF-α、IL-10采用ELISA法检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。    1．2．3  统计学方法  处理结果计量资料用x±s，SPSS13.0软件进行团体t检验以及秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。2  结果    2．1 　胰腺/体质量比值和胰腺病理学评分  总体来看，AP组胰腺/体质量比值和胰腺病理学评分均较对照组明显升高(P<0.01)，AP+坎地沙坦组的胰腺/体质量比值和胰腺病理学评分较AP 组明显下降(P<0.05)，但仍高于对照组(P<0.01)。从时间段来看，AP组大鼠胰腺炎症评分从12 h至48 h逐渐增高，而应用坎地沙坦可改变这种趋势。见表1。    2.2  血清脂肪酶、TNF-α及IL-10的变化  AP组血浆血清脂肪酶、TNF-α、IL-10水平较对照组明显升高(P<0.01)，AP+坎地沙坦组血清脂肪酶、TNF-α水平较AP组明显降低(P<0.05)，而血清IL-10水平的改变无显著统计学意义（P>0.05）。从时间段上看，各模型组血清TNF-α和IL-10水平均在12 h为最高，此后逐渐下降，但仍维持在较高水平。见表2及图1，2。3  讨论     急性胰腺炎的发病机制牵涉众多环节，传统上认为酶原进入肠腔前被激活是急性胰腺炎发病的共同途径。近年来的研究证明血液微循环障碍是急性胰腺炎的特征之一，其不仅可作为急性胰腺炎的始发因素，同时在急性胰腺炎转化过程中起着重要的作用[6-7]。传统上认为RAS具有强有力的血管收缩和刺激醛固酮分泌的作用，参与血压、体液和电解质平衡的内分泌调控。但近年来相继在脑、心脏、肺脏、肾脏、肾上腺、性腺、周围血管和胰腺等多种组织中发现RAS存在的证据，提示RAS在这些组织中通过自分泌或旁分泌的方式独立发挥生理调控功能[8]。    在急性胰腺炎发病过程中，RAS可能通过调节血供、炎症介质、氧分压、自由基等机制发挥一定作用，抑制其活性可能对胰腺有保护效果。Greenstein等[9]研究表明急性胰腺炎患者血浆肾素含量是正常人的5倍。Leung等[10]发现急性胰腺炎动物模型胰腺组织中肾素、血管紧张素原在胰腺组织内的含量增加，进而引起血管紧张素Ⅱ的增加。Pupilli等[11-12]证明人类血管平滑肌细胞表达VPF/VEGF 的mRNA，血管紧张素Ⅱ可以有效促进血管平滑肌细胞的VPF-mRNA表达。血管紧张素Ⅱ促使血管通透性因子（VPF）合成、分泌，而VPF是血管内皮细胞的一种蛋白，它促使血浆大分子渗出和细胞滤过，增加组织水肿。另外，Schieffer等[13]发现血管紧张素Ⅱ增加氧自由基，活化JAKs和STAT，从而增加IL-6合成。血管紧张素Ⅱ还在单核细胞和白细胞的迁徙、黏附过程中起作用[14-15]。急性胰腺炎时局部RAS激活，出现大量炎症因子进入血液循环，包括TNF-α、IL-1、IL-6及其他介质如血小板活化因子、IL-8和活化补体等，可能与胰腺组织损伤(如血管损伤等)有关。这些资料提示RAS在诱发组织炎症方面起作用[16]。目前已有实验表明，在雨蛙肽诱导的急性胰腺炎动物模型中，胰腺组织局部RAS在基因和蛋白质水平表达都显著上调，应用AT1受体拮抗剂洛沙坦可以抑制RAS的激活，减轻胰腺的病变程度[17]。    坎地沙坦为目前上市的所有AT1受体拮抗剂中最有效的一种，一次用药后体内持续有效时间为24 h。应用L-精氨酸诱导大鼠急性胰腺炎模型无须手术，而且用药次数少，可有效减少实验动物的应激反应。本实验证明AT1受体拮抗剂坎地沙坦应用于L-精氨酸诱导的大鼠急性胰腺炎模型中，亦可使胰腺炎明显减轻，使不同时相（12 h，24 h，48 h）处死的大鼠血浆脂肪酶均下降，胰腺/体质量比下降，胰腺水肿改善， 胰腺组织病理损伤减轻，特别是血清TNF-α水平明显降低。由于TNF-α在急性胰腺炎的进展机制中起非常重要的作用，它通过诱导炎症反应加重局部的损伤[18]，所以抑制TNF-α对减轻胰腺损伤有着重要意义。而IL-10作为具有保护作用的细胞因子，其浓度的高低可预测急性胰腺炎的预后[19]。然而，应用坎地沙坦对血清IL-10无明显影响，说明在抗炎因子IL-10的合成释放过程中微循环的影响并非最重要的因素。总之，应用AT1受体拮抗剂抑制RAS，从而缓解急性胰腺炎严重程度，无论在理论研究还是临床应用方面都提供了一个新方法与新途径，为治疗急性胰腺炎提供了新思路。【参考文献】[1] Wilson C， Imrie CW. 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