3TSR抑制裸鼠胰腺癌血管生成及其与VEGF表达的关系

3TSR抑制裸鼠胰腺癌血管生成及其与VEGF表达的关系作者：金洲祥，王飞海，朱少俊    作者单位：温州医学院第二附属医院 普外科，浙江 温州 　325027    【摘要】  目的 研究血管形成抑制剂3TSR对胰腺癌血管形成的影响，并探讨其与血管内皮生长因子(vasular endothelial growth factor，VEGF)表达的关系。方法 建立裸鼠原位胰腺癌模型，进行随机干预实验，实验分为对照组、3TSR1组(每天腹腔注射3TSR 1 mg/kg)，3TSR2组(每天腹腔注射3TSR 2 mg/kg)，3TSR3组(每天腹腔注射3TSR 3 mg/kg )，每组7只。干预3周后，检测瘤体体积、肿瘤微血管指标，用ELISA法测定外周血VEGF含量，RT-PCR法测定肿瘤组织VEGF mRNA的表达。结果 治疗组平均肿瘤体积均低于对照组， 差异有统计学意义(P<0.05)，其中3TSR2组和3TSR3两组均低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组平均微血管数、平均微血管面积及平均微血管密度均低于对照组，其中3TSR2和3TSR3两组其平均微血管面积和平均微血管密度低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF外周血含量对照组为(85±21)pg/ml，3TSR1组为(36±13)pg/ml，3TSR2组为(30±9)pg/ml，3TSR3组为(28±7)pg/ml。治疗组VEGF含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR提示治疗组的VEGF mRNA含量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中3TSR2和3TSR3两组均低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 3TSR能显著减小肿瘤体积，抑制微血管生长，其机制可能与抑制VEGF表达有关。本研究为3TSR的临床前期应用提供了一定实验基础。    【关键词】  3TSR;胰腺肿瘤;血管形成;血管内皮生长因子;大鼠;动物模型    The inhibitory effect of 3TSR on angiogenesis of pancreatic cancer in nude mice and its relationship with expression of VEGF JIN Zhouxiang， WANG Feihai， ZHU Shaojun. Department of General Surgery， the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027　　Abstract Objective To investigate the inhibitory effects of 3TSR on angiogenesis of pancreatic cancer and explore its relationship with expression of vascular endothelial growth factor(VEGF). Methods After human orthotopic pancreatic cancer model in nude mice was established， the mice were divided into four groups： control group， 3TSR1 group (3TSR 1 mg/kg·d by i.p. injection)， 3TSR2 group (3TSR 2 mg/kg·d by i.p. injection) and 3TSR3 group (3TSR 3 mg/kg·d by i.p. injection) with 7 mice in each group. The tumor volume and microvessel index were detected， respectively. VEGF protein was detected with ELISA and VEGF mRNA with RT-PCR， respectively. Results Compared with control group， study showed that tumor volume in 3TSR1 group， 3TSR2 group and 3TSR3 groups reduced significantly. The tumor volume of 3TSR2 and 3TSR3 groups were significantly lower than that in 3TSR1 group， respectively (P<0.05). The average microvessel number， the average microvessel area and the average microvessel density in treated groups were significantly lower than control group (P<0.05). The average microvessel area and the average microvessel density in 3TSR2 and 3TSR3 groups were significantly lower than those in 3TSR1 group， respectively (P<0.05). The serum VEGF content in above-mentioned treated groups was (36±13)pg/ml， (30±9)pg/ml and (28±7)pg/ml， respectively， significantly lower than that of control group (P<0.05). What’s more， the expression of VEGF mRNA in treated groups were lower than that of control group (P<0.05). And the expression of VEGF mRNA in 3TSR2 and 3TSR3 groups were lower than that of 3TSR1 group (P<0.05). Conclusion 3TSR decreases the tumor volume significantly and inhibits the angiogenesis of pancreatic cancer. The mechanism of anti-angiogenesis effects of 3TSR may be related to the inhibitory of VEGF expression. Study provided some basic data for future pre-clinical and clinical application of 3TSR.　　Key words three hrombospondin-1 type 1 repeats; pancreatic neoplasms; angiogenesis; vascular endothel　　胰腺癌手术切除率低，对化学治疗和放射治疗不敏感，术后易复发转移，预后差[1]。目前，采用新生血管形成抑制因子治疗肿瘤已成为当前肿瘤治疗的研究热点之一。　　TSP-1(thrombospondin-1) 是一种最早发现的具有抗新生血管形成和抑制肿瘤生长的天然三聚体高分子糖蛋白，许多研究表明它对实质性肿瘤具有治疗作用，但大剂量应用有许多副作用，临床应用受到限制。3TSR(three thrombospondin-1 type 1 repeats)是TSP-1抗新生血管形成的功能结构域，具有与TSP-1相似的抗新生血管形成作用而其他副作用少，人类的3TSR现已被哈佛医学院Beth Isreal Deaconess医学中心病理实验室提纯，初步研究表明3TSR具有明显的抗肿瘤作用[2]，我们的初步研究也表明3TSR能显著抑制裸鼠胰腺癌的生长，抑制血管生成并能抑制癌肿的远处转移[3-5]，但其抗肿瘤血管生成机制仍未明确。本研究利用TSP-1的抗新生血管形成的结构功能域3TSR，观察其对胰腺癌血管形成的影响，并探讨与VEGF表达的关系。1 材料和方法　　1.1 材料 人类胰腺癌细胞株MIAPaCa-2(湖南远泰生物公司)，3TSR由Jack Lauler教授提供(Beth Israel Deaconess Medical Center，MA)，DMEM(南京凯基生物公司)，胰蛋白酶(Sigma)，鼠抗CD31(BD PharMingen，SanDiego，CA)，胎牛血清(FBS)，RT-PCR 试剂盒、血管内皮生长因子(VEGF)的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒购自深圳晶美生物工程公司。　　1.2 方法　　1.2.1 细胞培养 胰腺癌细胞株MIAPaCa-2使用含10%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 U/ml青霉素和50 mg/ml链霉素的DMEM培养基，细胞置于37℃、100%相对湿度和含5% CO2空气的细胞培养箱中培养。　　1.2.2 裸鼠原位胰腺癌药物干预模型建立和体积测定 MIAPaCa-2细胞悬液调整至每毫升5×106个细胞，0.2 ml细胞悬液(含1×106个细胞)接种于28只免疫缺陷雌鼠胰腺，1周后随机分为对照组(每天腹腔注射生理盐水0.2 ml)，3TSR1组(每天腹腔注射3TSR 1 mg/kg)，3TSR2组(每天腹腔注射3TSR 2 mg/kg)，3TSR3组(每天腹腔注射3TSR 3 mg/kg)，每组7只，连续注射3周后处死动物模型，解剖提取肿瘤，测定肿瘤体积(V=1/6×π×长×高×宽)。肿瘤组织用液氮速冻，-80℃冷藏。　　1.2.3 CD31免疫组化微血管染色 肿瘤组织切成5 ?滋m厚组织片行CD31免疫组化染色切片，切片经PBS洗涤后置于含3% H2O2甲醇中20 min，中和内源性过氧化物酶。PBS洗涤，含5%兔血清PBS孵化30 min，PBS洗涤，加一抗：鼠抗CD31抗体1∶200溶解于含5%兔血清PBS中室温3 h，PBS洗涤，加二抗：兔抗鼠IgG 1∶200溶解于含5%兔血清PBS中室温1 h。PBS洗涤，加ABC试剂45 min，PBS洗涤，加DAB试剂(2 ml蒸馏水加入1滴buffer，2滴DAB液再加入1滴H2O2) 2 min，清水清洗，苏木素染色20 s，脱水封片。每种肿瘤标本切片5张行CD31染色，而后在携带数码相机的Nikon TE-300显微镜下摄片，在每张染色片上摄取4处微血管丰富的热点区域(非坏死区)，面积为0.584 mm×0.438 mm，即20个热点区域。而后采用IP-Lab软件计算肿瘤微血管数和肿瘤微血管面积;并计算肿瘤微血管密度(肿瘤微血管数/0.584 mm×0.438 mm×100%)、微血管面积百分比(肿瘤微血管面积/0.584 mm×0.438 mm×100%)。　　1.2.4 裸鼠外周血中VEGF含量的测定 按ELISA法试剂盒操作说明书测定VEGF的含量。　　1.2.5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测裸鼠瘤体组织VEGF mRNA表达 应用Trizol试剂(Gibco)，按照产品说明书提取各组织总RNA。取5 μg RNA逆转录合成cDNA链。取2 ?滋l cDNA作为模板，加入VEGF引物：5′-atgaactttctgctgtcttg-3′，5′-tgcatggtgatgttggac-3′，经过95℃变性5 min后进入循环，包括95℃变性45 s，54℃退火90 s，72℃延伸90 s，30 个循环。扩增片段为382 bp。以GAPDH(5′-ggtgaaggtcggtgtgaacgga-3′;5′-tgttagtggggtctcgctcctg-3′，223 bp)作为内参。取10 ?滋l扩增产物用1.7%的琼脂糖凝胶电泳，自动凝胶成像系统拍照。对目的电泳条带进行A峰值下面积积分，以(VEGF/β-actin)×100%作为VEGF mRNA的相对表达水平，并比较其变化。　　1.2.6 统计学方法 所有计算数据采用x±s来表示，组间的多重比较采用方差分析和LSD-t检验，并采用SPSS10.0软件分析处理，P<0.05为差异有统计学意义。2 结果　　2.1 平均肿瘤体积 各治疗组与对照组小鼠均存活4周，各组间小鼠体质量差异无统计学意义，处死动物模型，解剖提取肿瘤，测定肿瘤体积。对照组平均肿瘤体积是(1214.6±178.6)mm3，而3TSR1组、3TSR2组和3TSR3组平均肿瘤体积分别为(537.3±122.63)mm3，(394.2±107.8)mm3和(342.7±78.3)mm3，均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。其中3TSR2组和3TSR3两组又均低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)，但3TSR2组和3TSR3两者间差异无统计学意义(P>0.05)，见表 1。　　2.2 肿瘤单位面积微血管指标测定 治疗组平均微血管数、平均微血管面积及平均微血管密度均低于对照组，其中3TSR2组和3TSR3两组其平均微血管面积及平均微血管密度又均低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)，但两者间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。　　2.3 裸鼠外周血中VEGF含量的测定 4组裸鼠血浆中均可以检测到VEGF。其中，对照组为(85±21) pg/ml，3TSR1组为(36±13)pg/ml，3TSR2组为(30±9)pg/ml，3TSR3组为(28±7)pg/ml。治疗组VEGF含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，但3TSR1、3TSR2组和3TSR3三者间差异无统计学意义(P>0.05)。　　2.4 4组裸鼠原位移植瘤组织中VEGF mRNA的表达(见图1) 4组裸鼠原位移植瘤组织中均检测出VEGF mRNA的表达。对照组为79%±25%，3TSR1组为58%±14%，3TSR2组为37%±9%，3TSR3组为41%±12%。其中治疗组VEGF mRNA含量均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，其中3TSR2组和3TSR3两组又均低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)，但3TSR2和3TSR3两者间差异无统计学意义(P>0.05)。3 讨论　　胰腺癌解剖位置特殊和生物学侵袭性高，易发生早期腹膜后直接浸润和肝转移，手术切除率低[6]。虽然近年来新的化疗药物健择的出现大大改观了胰腺癌的治疗效果，但总反应率仍低于25%[7]。胰腺癌治疗效果的根本提高在于新药的发现或新的治疗方案的出现。血管抑制是近几年肿瘤治疗的热点，现在的观点认为[8]：当肿瘤体积增至2～3 mm3时，如果没有新生血管长入，肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。一旦血管长入肿瘤，肿瘤的血液供应变为灌注，肿瘤将呈指数生长并达到难以控制的体积。抗血管生成可以使肿瘤体积缩小到无血管状态，因此抗血管治疗有望为胰腺癌提供新的治疗途径。　　3TSR是近年来提纯的一种新的抗新生血管形成因子，是最早发现的新生血管形成抑制因子TSP-1的一个结构功能域，它保留了TSP-1抑制血管形成的功能，但大大减弱TSP-1其他功能引起的副作用，因此，3TSR具有临床应用前景。　　本实验研究结果表明3TSR1、3TSR2和3TSR3组肿瘤体积较对照组明显降低，而且3TSR1、3TSR2和3TSR3组平均微血管数、平均微血管面积及平均微血管密度均低于对照组，差异有统计学意义。其中3TSR2和3TSR3两组平均微血管面积及平均微血管密度又均低于3TSR1组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示3TSR能显著减少肿瘤体积，并抑制胰腺癌新生血管的形成。而且3TSR2组和3TSR3组抗肿瘤作用均高于3TSR1组，而3TSR2组和3TSR3组两者间差异无统计学意义，说明3TSR对胰腺癌抑制作用在一范围内呈浓度依赖性，2～3 mg/kg为裸鼠胰腺癌治疗理想的可选剂量。　　VEGF是作用最强的促血管生长因子，能特异性刺激血管内皮细胞增殖与血管生成;肿瘤表达增高，可促进新生血管生成，与MVD、肿瘤恶性程度呈正相关[9]。VEGF 可诱导内皮细胞增殖和抑制细胞凋亡，在体内可诱导血管生成和增加血管的通透性，是血管形成过程中起核心作用的因子[10]。　　本研究发现，3TSR能显著减少外周血VEGF含量，并抑制VEGF mRNA的表达，表明3TSR对胰腺癌血管生长的抑制作用可能与抑制VEGF表达有关，从而抑制内皮细胞增殖和促进其凋亡。　　本研究结果表明3TSR能显著减少肿瘤体积，抑制肿瘤新生血管形成，其机制可能与抑制VEGF表达有关。3TSR作为一种新型血管形成抑制因子具有开发应用价值。【参考文献】　　[1] Ionescu M， Stroescu C， Ciurea S， et al. 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