禽脑脊髓炎病毒基因组的BLASTN/P分析

　　作者：孟佩俊 刘丽华 张丽萍 王嘉慧 作者单位：包头医学院公共卫生学院卫生化学教研室，内蒙古 包头 014010;内蒙古工业大学化工学院生物化工系

　　【摘要】 目的：从基因组水平出发，为禽脑脊髓炎病毒(AEV)的属种划分提供依据。方法：利用生物信息学方法，对AEV基因组序列和多聚蛋白质序列进行BLASTN/P搜索，找出与AEV基因组和多聚蛋白序列具有最大同源性的序列。结果：AEV与HAV的基因组序列和蛋白序列的同源性最大。结论：AEV与HAV的亲源关系最近，建议将AEV归类为小RNA病毒科甲肝病毒属。

　　【关键词】 禽脑脊髓炎病毒,基因组,BLASTN/P分析

　　Abstract Objective：To provide reference for the taxonomy of avian encephalomyelitis virus(AEV) from the genome level.Methods：The BLASTN/P searching of AEV-associated Picornaviridae genome and polyprotein were completed by bioinformatics methods, the most identity sequence were also found with AEV in both the genome and polyprotein from the NCBI GenBank.Results：AEV have the most identity with HAV in both sides.Conclusion：AEV has the nearest evolutionary relationship with HAV.So, it was supposed that AEV should be assigned to the genus Hepatovirus of Picornaviridae with HAV.

　　Key words Avian encephalomyelitis virus;Genome;BLASTN/P analysis

　　禽脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis, AE)又称流行性震颤(Epidemis Tremor)是由禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的以侵害幼鸡为主的急性、高度接触性传染病[1-2]。AEV属于小RNA病毒科的一个成员，呈球形，无囊膜。电镜检测表明，AEV粒子具有20面体对称和有32～42个壳粒的5重对称，直径为22～25nm[3-5]。

　　AEV基因组长为7055 nt(编码的多聚蛋白由2 134aa组成)，其基因组结构与其它小RNA病毒相似，即整个基因组相当于一条成熟的mRNA分子，且3’端有poly A尾，与真核mRNA相类似;另外，其基因组编码区编码11种蛋白，这又类似于原核生物mRNA的多顺反子结构。编码蛋白呈434结构，即基因组编码区编码的“多聚蛋白”从N端到C端依次为：结构蛋白P1区(裂解为1A、1B、1C和1D共4种外壳蛋白)、非结构蛋白P2区(裂解为2A、2B和2C蛋白)和P3区(裂解为3A、3B、3C和3D蛋白)。小RNA病毒基本上具有相同的基因复制特点，它们都是由一个共同的祖先经过长期进化形成的异质群(quasispecies)。

　　BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是目前国际上3大生物信息中心数据库之一的美国国立卫生研究院和国家生物技术研究中心(The National Center for Biotechnology Information, NCBI)开发的同源性检索软件，是一套在DNA数据库或蛋白质数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST在一定程度上起到核酸杂交试验的作用，所以又称为电子杂交。BLASTN是从核酸序列到核酸库中的一种查询，所输入的序列将与库中存在的每条已知序列作一对一的核酸序列比对。BLASTP是从蛋白序列到蛋白库中的一种查询，所输入的序列将与库中存在的每条已知序列作一对一的氨基酸序列比对。BLAST为目前生物信息学(Bioinformatics)研究上极为重要的工具，特别是在数据库的搜寻、与核酸或氨基酸序列相似度的比对方面，是目前使用最为广泛的应用方法[6-8]。

　　本文利用生物信息学方法，对AEV的基因组序列用NCBI网站提供的BLASTN和BLASTP程序进行生物分子序列数据库搜索，试图通过数据库的搜索找到与AEV核酸序列和蛋白质序列具有最大同源性的序列，为AEV的属种划分提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 AEV全基因组及多聚蛋白序列来源 AEV全基因组及多聚蛋白序列来源于NCBI的核酸序列数据库GenBank(登录号NC_003990)。

　　1.2 分析方法 通过NCBI BLASTN/P在线分析系统，用AEV全基因组序列及其编码的“多聚蛋白”序列分别搜索非冗余核酸序列和蛋白序列数据库，找出与AEV具有较高序列同源性的基因组序列和蛋白序列。

　　2 结果与讨论

　　AEV全基因组的NCBI BLASTN分析结果 结果表明AEV在基因组的1 261～1 304(44nt)、1 533～1 597(65 nt)和5 337～5 371(35nt)区域与HAV的相应基因区域存在88%、84%和91%的同源性。其中前两处均位于基因组的3C区域，最后一处位于3D区域，而在其它区域显著相似的序列片段较少，见图1。

　　图1 AEV全基因组核酸序列数据库搜索结果(略)

　　1、2、3为与AEV具有较高序列同源性的甲型肝炎病毒(HAV，GenBank登录号NC_001489)基因片段

　　AEV基因组编码的多聚蛋白序列NCBI BLASTP分析结果 搜索结果表明，在AEV多聚蛋白的1～733aa区域(覆盖多聚蛋白P1区达95%)与HAV的不同株系有47%～49%的同源性;在多聚蛋白的1 023～2 121aa区域(覆盖多聚蛋白2C-P3区达99%)与HAV的不同株系有36%～38%的同源性; AEV和HAV在整个1C和2C蛋白区域的同源性分别为51%和40%;在1 662～2 065aa区域(覆盖3D蛋白区的83%)同源性为41%。另外，AEV多聚蛋白在319～475aa区域(覆盖3C蛋白区的64%)、1 143～2 125aa区域(覆盖2C-P3蛋白区的88%)与AiV的相应蛋白区域有25%和27%的同源性;在1 143～2 121aa区域(覆盖多聚蛋白2C-P3区达99%)与PV1有26%的同源性;在2～527aa区域(覆盖多聚蛋白P1区达68%)和1 049～2 121aa区域(覆盖多聚蛋白2C-P3区达96%)与PV2有20%和26%的同源性。见图2。

　　图2 AEV多聚蛋白序列数据库搜索结果(略)

　　AiV为Aichi virus(GenBank登录号AAY46271.1);PV1为人脊髓灰质炎病毒1 Sabin株(GenBank登录号AAV91151.1);PV2为人脊髓灰质炎病毒2(GenBank登录号AAO45820.1)

　　经上面AEV的BLASTN/P搜索结果分析可知，与其它小RNA病毒相比，AEV在基因组序列和蛋白序列与HAV在P1和2C-P3区域有较大的序列相似性，而在2A和2B区域没有显著相似的序列片段，这可能是小RNA病毒2A蛋白和2B蛋白多样性的结果[4]。鉴于AEV和HAV的基因组和蛋白序列在较大区域存在较高的序列相似性，我们又利用NCBI的Blast 2程序对它们的全基因组和多聚蛋白序列进行了比较，其中基因组比较结果表明AEV在1 533～1 633(101nt，位于基因组的1C区)区域处与HAV的相应序列存在79%的同源性;而蛋白序列Blast 2比较没有发现重要信息，见图3。这一结果一方面是由比对参数设置所导致，但同时也反映了AEV与HAV的蛋白序列相似性明显低于基因组序列相似性这一生物学现象。

　　图3 AEV和HAV全基因组核苷酸序列Blast2比较结果(略)

　　Query是AEV基因组片段;Sbjct是HAV基因组片段

　　AEV属于小RNA病毒科，因其理化特性与肠道病毒相似，1995年公布的第六次国际病毒学分类报告将AEV划分为肠道病毒属 [9-11]。但从上面分析结果可知，AEV与HAV存在最大的序列同源性;另外，我们的前期工作小RNA病毒基因组结构比较及进化树分析结果表明：AEV与HAV在全基因组和多聚蛋白序列两方面与其他小RNA病毒相比均存在最大的序列相似性，分别为39.7%和28.3%，而与肠道病毒在这两方面的相似性分别为24.7%～25.9%和9.2%～13.1%，就整个小RNA病毒科而言，AEV与HAV处于同一个进化树分支。因此，从基因组水平出发应该把AEV归为小RNA病毒科甲肝病毒属。2000年第7次国际病毒分类报告已把AEV定为甲肝病毒属的暂定种(Tentative Species)[12]，至于其最终归属，还需要对AEV进行更深入的研究以及国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV)对病毒分类原理和依据的进一步完善。

　　【参考文献】

　　[1] Jones EE.An encephalomyelitis in the chicken[J].Science，1932，76：331-333.

　　[2] Jones EE.Epidemic tremor，encephalomyelitis affecting yo-ung chickens[J].Journal of Experimental Medicine，1934，59：781-798.

　　[3] 马学恩，赵振华.禽脑脊髓炎病毒的提纯和电镜观察[J].中国兽医科技，1995，25(7)：3-4.

　　[4] 葛俊伟，关云涛，杨增岐，等.禽脑脊髓炎研究进展[J].动物医学，2003，20(10)：62-64.

　　[5] 刘丽华，马学恩，顾玉芳，等.禽脑脊髓炎病毒内蒙古分离株3′端序列的克隆及序列分析[J].甘肃畜牧兽医，2003，33(2)：4-5.

　　[6] 代宁.Internet上生物学数据库和软件资源的利用[J].生物学通报，2002，37(7)：27-29.

　　[7] 李建波.Internet上的生物信息资源及获取[J].生物学通报，2002，37(7)：30-31.

　　[8] McGinnis S, Madden TL.BLAST：at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools[J].Nucleic Acids Res，2004，32：W20-W25.

　　[9] 殷震，刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社，1997：365.

　　[10] 张二芹，赵振华，孙明，等.禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析[J].中国兽医科技，2004，34(3)：51-55.

　　[11] 韦莉，刘爵，曹永长，等.禽脑脊髓炎病毒VP0基因的克隆与序列测定[J].病毒学报，2001，17(1)：3.

　　[12] King AQ，Brown F，Christian P，et al.Picornaviridae.(In)：Eds Van Regenmortel.Virus Taxonomy，Seventh Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses[M].New-York：Academic Press，2000：657-673.