精氨酸对梗阻性黄疸大鼠肝损伤的保护作用及其对肝细胞凋亡的影响

精氨酸对梗阻性黄疸大鼠肝损伤的保护作用及其对肝细胞凋亡的影响作者：刘文生，吴德全，杨书龙，许军    作者单位：1.哈尔滨医科大学第四附属医院 普外科，黑龙江 哈尔滨 150086；2.哈尔滨医科大学第二附属医院 普外科，黑龙江 哈尔滨 150086    【摘要】  目的 探讨梗阻性黄疸时精氨酸是否对肝脏具有保护作用及其对肝细胞凋亡的影响。方法 Wistar大鼠42只随机分为3组：A组为假手术组、B组为梗阻性黄疸组、C组为精氨酸治疗组；B组和C组采取双重结扎大鼠胆总管制作梗阻性黄疸模型，C组术后第1天开始每天腹腔注射精氨酸500 mg/（kg·d），分别于术后第7天和第14天取材，采集鼠血清检测TBIL、DBIL、ALT、AST；大鼠肝脏组织进行HE染色切片观察组织形态，电镜观察胞内形态并对组织切片应用Bax、Bcl-2试剂盒行免疫组化染色。结果 与A组大鼠相比，B组大鼠血清胆红素和转氨酶明显增高，肝细胞损伤不断加重并出现显著凋亡改变，随着胆总管结扎时间的延长而更加明显。应用精氨酸治疗的C组大鼠，其肝功能和肝脏组织病理学改变较B组轻。B组和C组大鼠肝组织中Bax、Bcl-2蛋白表达均随时间而增多，但B组Bax表达增多较明显，而C组Bcl-2蛋白表达增多较明显。结论 精氨酸对梗阻性黄疸大鼠肝脏有保护作用，可能是通过上调肝脏组织Bcl-2蛋白表达，下调肝脏组织Bax蛋白的表达减少细胞凋亡来实现的。    【关键词】  梗阻性黄疸；细胞凋亡；精氨酸；大鼠    Observation of arginine’s protection from hepatic injury and its effect on hepatic cell apoptosis in the rats with obstructive jaundice　LIU Wensheng，WU Dequan，YANG Shulong，et al.  　　Department of General Surgery， the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Harbin 150086　　Abstract   Objective  To explore whether arginine could lighten the hepatic dysfunction of rat with obstructive jaundice (OJ) and the influence of arginine on hepatic cell apoptosis. Methods  A total of 42 adult Wistar rats were studied. They were divided into three groups： the sham operation group(A group)， the OJ group (B group) and the group of OJ rats administered arginine (C group). The B and C group were established by double-ligating bile duct (BDL). Abdomenal injections of arginine (500 mg/kg·d) postoperatvely was administered daily in C group. Three groups of rats were sacrificed after 1 and 2 weeks of postoperation， respectively. The levels of serum total bilirubin (TBIL)， direct bilirubin (DBIL)， alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were tested and the tissue’s histopathology and ultrastructure changes were observed； the immunohistochemical technique was used for detecting the Bcl-2 and Bax protein expression. Results  With the time of BDL extending， the values of serum ALT， AST， TBIL and DBIL were increased and the value of B group was  higher than that of A group (P<0.05)； following that cell apoptosis increased apparently in hepatic tissue. Compared with B group， the injury degree of hepatic function and histopathology of changes in C group were decreased. With the time extending， the Bcl-2 and Bax protein of both B and C group were increased. The Bcl-2 was increased more evidently in C group， just like Bax in B group. Conclusion  Arginine can ease the degree of hepatic functional injury， for it may decrease cell apoptosis by up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax in hepatic tissue.　　Key words   obstructive jaundice； cell apoptosis； arginine； rats　　梗阻性黄疸是外科常见的一种疾病，可直接导致肝细胞损伤乃至肝功能衰竭，并且常伴不同程度的肾功能损害。有证据显示，细胞凋亡在梗阻性黄疸导致的肝肾损害的病理过程中起重要作用[1-2]。最近的研究表明，给予精氨酸可以改善机体状态，减轻梗阻性黄疸时大鼠肾小管上皮细胞凋亡[3]。因此本研究将重点探讨外源性精氨酸对梗阻性黄疸大鼠肝细胞凋亡有无影响及其调控机制，进一步加深对梗阻性黄疸病理改变的认识并探索新的治疗策略。1  材料和方法　　1.1  动物实验和分组 　　Wistar大鼠42只，质量180~250 g，雌雄不限，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。将大鼠随机分为假手术组（A组，14只），梗阻性黄疸组（B组，14只），梗阻性黄疸+精氨酸治疗组（C组，14只）。术后第1天开始每天对C组大鼠给予精氨酸500 mg/kg腹腔内注射。各组术后再随机分为第7、14天两个时相点，每个时相点7只，在时相点处死大鼠后门静脉抽血，离心取上层血清后置-70℃冰箱保存待行肝功能测定；并留取肝右叶组织待行组织形态学及免疫组化观察。　　1.2  梗阻性黄疸模型的建立 　　10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，取上腹部右旁正中切口入腹腔，于肝十二指肠韧带内辨认胆总管，距离十二指肠1.5~2.0 cm处游离胆总管约0.5 cm。除A组外，其他大鼠均双重结扎胆总管，双扎之间离断胆总管。局部喷洒庆大霉素后关腹。术毕禁食8 h后自由饮食。　　1.3  肝功能检测 　　大鼠血清丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）采用全自动生化分析仪测定。　　1.4  组织形态学观察 　　把肝右叶组织分别用10%中性甲醛缓冲液和2.5%戊二醛固定，按常规方法制作HE切片和电镜切片，光镜下及透射电镜下观察组织形态学变化。　　1.5  Bax和Bcl-2蛋白表达测定 　　免疫组织化学方法观察肝细胞Bax、Bcl-2蛋白表达 采用二步法检测。细胞浆出现棕黄色颗粒为染色阳性细胞，切片内无棕黄色颗粒染色细胞为阴性表达。染色结果综合染色强度及阳性细胞数量两个方面进行半定量分析，分别评为0~3分。染色强度：阴性（0分），浅黄色（1分），棕黄色（2分），棕褐色（3分）。阳性细胞数计分：无着色细胞（0分），阳性细胞率小于1/3（1分），1/3~2/3（2分），大于2/3（3分）。根据两项结果相加分数判断结果：0分（-），1~2分（+），3分（+），4分（++），5~6分（+++）。结果判断和数据处理采用网格测试法。　　1.6  统计学方法 　　所有实验数据以x±s表示，采用SPSS软件进行统计学处理。统计学差异检验采用方差分析t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  术后一般情况及取材肉眼所见 　　B组大鼠胆总管结扎术后12 h出现尿色加深，术后2 d出现皮肤及巩膜黄染，大便颜色变浅，随梗阻时间的延长大鼠反应逐渐迟钝，取材时可见全部胆总管结扎成功，胆总管明显增粗，直径由正常的1 mm增至1.5~5 mm不等；肝脏肿胀，边缘变钝，颜色由暗红转为棕黄色，质地变硬。C组大鼠梗阻性黄疸表现较B组轻。　　2.2  各组肝功能检查 　　随胆总管结扎时间的延长，大鼠血清中胆红素和转氨酶水平逐渐升高，B、C组术后血转氨酶和胆红素均高于A组，差异有统计学意义（P<0.05）；同一时相相比，B组转氨酶水平高于C组，差异有统计学意义（P<0.05），但胆红素水平差异无统计学意义（P>0.05）。详见表1。　　2.3  光镜下各组肝脏病理改变 　　A组的肝脏病理情况在两个时相均未发现明显异常。B组胆总管结扎7 d时可见凋亡病变的肝细胞，表现为细胞浆及核均固缩；部分肝细胞变性，可见少量灶状坏死及少量纤维组织增生；淋巴细胞、中性粒细胞浸润；胆小管扩张。结扎14 d时凋亡变的肝细胞明显增多；汇管区周围大量肝细胞变性，还可见多种形态的坏死灶；炎性细胞浸润，肝细胞索松散，纤维组织增生，肝脏结构改变（见图1）。C组病理改变较B组轻，在7 d时未见明显凋亡变细胞；可见很少的肝细胞损伤变性，未见片状坏死灶。14 d时可见少量凋亡变细胞；损伤的肝细胞略有增多，汇管区轻度炎性细胞浸润，纤维组织少量增生（见图2）。　　2.4  透射电镜下各组肝脏病理改变 　　A组肝细胞核圆，核仁明显；胞质内有丰富的线粒体结构，嵴清晰，基质密度适中；质膜、细胞内膜完好。　　B组胆总管结扎7 d时可见部分肝细胞出现凋亡改变，细胞核内染色质分布不均匀，染色质颗粒向异染色质区集中，有的形成染色质块，分布于核周边部，电子密度高于正常；核膜和细胞膜均完整，但有皱缩、凹陷，内质网变化不明显；可见线粒体肿胀，内嵴部分缺失，并可见吞噬体颗粒。结扎14 d时肝细胞凋亡改变更加明显，细胞核中染色质凝集，呈不均匀团块状分布于核周边部，局部核膜内陷；溶酶体增多，吞噬体数目明显增多；线粒体嵴大部分缺失，基质密度下降，可见空泡变性及絮状物改变，凋亡细胞的核膜和细胞膜尚完整，毛细胆管扩张，微绒毛消失（见图3）。C组肝细胞凋亡改变较轻，少量细胞内染色质分布不均匀，可见异染色质边集现象，但未凝集成块，线粒体轻度肿胀，核膜和细胞膜均完整（见图4）。　　2.5  各组肝组织细胞Bax、Bcl-2的表达情况 　　A组阴性表达或弱表达，胆总管结扎后，B组和C组大鼠肝组织中Bax、Bcl-2蛋白表达均随时间而增多，但明显有区别的是B组Bax表达增多较明显，而C组Bcl-2蛋白表达增多较明显。详见表2。3  讨论　　细胞凋亡又称程序化细胞死亡，在生物体内广泛存在，由特定基因控制，是以DNA断裂降解为特征的细胞死亡方式。大量研究表明，细胞凋亡异常与许多疾病如恶性肿瘤、自身免疫疾病等的发病机制有着紧密联系。Miyoshi等[4]研究证明，肝细胞凋亡是梗阻性黄疸肝细胞死亡的主要形式，在梗阻性黄疸引起的肝损伤中发挥重要作用。在本实验研究中我们应用组织学光镜和透射电镜，观察到在梗阻性黄疸大鼠肝脏细胞凋亡改变贯穿整个病程，与假手术对照组相比，血清胆红素和转氨酶水平明显增高，肝脏病理改变逐渐加剧，炎症加重，肝细胞减少，纤维变倾向，超微结构改变显著。梗阻性黄疸时致使肝细胞损伤发生凋亡的因素如下。?譹?訛内毒素：胆道梗阻后，由于肠道胆盐缺乏，清除内毒素的能力下降，大量内毒素吸收入血，形成肠源性内毒素血症。内毒素主要通过刺激单核吞噬系统产生TNF-α引发细胞凋亡；内毒素也可直接致肝细胞凋亡[5-6]。?譺?訛氧化自由基损伤：胆道梗阻后肝脏有效血流量明显减少，缺血低氧以及淤积的胆盐均可导致线粒体呼吸链电子传递障碍，促进氧自由基的生成[7]，同时自由基清除酶系在体内的合成减少，自由基清除能力下降，肝脏氧化自由基增多。多项研究表明自由基水平增加与细胞凋亡发生有关[8-9]，氧自由基能够导致DNA、蛋白质、质膜的氧化损伤，从而导致细胞凋亡。?譻?訛钙超载：梗阻性黄疸时肝细胞内胆汁酸含量明显上升，肝细胞内线粒体受损，使肝细胞内氧化磷酸化产能减少，导致了肝细胞生物膜损伤、钙泵功能丧失，胞内钙离子浓度升高，触发凋亡。　　Bax和Bcl-2基因是目前最受关注的与细胞凋亡相关的基因，Bax和Bcl-2以二聚体的形式调控肝细胞凋亡。Bcl-2对细胞凋亡有明显的抑制作用，而Bax拮抗Bcl-2，促进凋亡。Bcl-2 蛋白、Bax蛋白均参与阻塞性黄疸肝细胞中细胞凋亡的调节，并在梗阻性黄疸损害的发生、发展中起着重要作用[10]。本实验显示A组Bcl-2、Bax蛋白阴性或弱表达，B组和C组胆总管结扎后Bcl-2、Bax蛋白表达均增加，B组大鼠促凋亡的Bax增加较明显，Bax同二聚体增多从而促进细胞凋亡；C组大鼠Bcl-2增加较明显，促进形成Bcl-2/Bax二聚体，Bcl-2同二聚体增多从而抑制细胞凋亡。　　精氨酸是一种特殊的半必须氨基酸，在一氧化氮合酶（NOS）的作用下可生成一氧化氮（NO），在体内广泛发挥作用。在梗阻性黄疸的状态下，它具有更加特殊的作用，如提高免疫力、增加食欲、减少体质量丧失等。但其生成的NO在病理生理条件下作用比较复杂。有研究表明，NO可以拮抗氧自由基，减轻脂质过氧化损伤，改善内毒素造成的机体损害，是一种细胞保护因子，但也有相反的观点。本研究中我们观察到C组应用精氨酸大鼠较B组大鼠转氨酶水平明显降低，肝脏病理改变也较轻，凋亡变细胞明显减少，损伤变性的细胞超微结构明显改善，线粒体增多，胞内膜结构完好，组织纤维变倾向不明显。可能的机制为外源性精氨酸可通过机体精氨酸—NO通路：?譹?訛可显著减少梗阻性黄疸时肠道细菌移位，改善免疫功能，恢复肝枯否细胞清除内毒素的能力；降低炎性因子的水平，扩张血管平滑肌，改善肠道的缺血、低氧，纠正能量代谢障碍，保护肠道屏障，减轻梗阻性黄疸时内毒素血症[11]；?譺?訛有效保护血管内皮细胞或肝细胞免受超氧自由基等有毒物质的损害，可通过减少炎性细胞浸润而减少氧自由基的生成及保存超氧化物歧化酶而加快氧自由基清除，降低氧自由基水平，减轻脂质过氧化损伤。精氨酸对细胞膜和细胞器膜可能有直接保护作用，透射电镜超微细胞结构可以看出精氨酸对膜结构的保护作用。　　总之，本研究中我们观察到梗阻性黄疸可诱发大鼠肝细胞出现凋亡，精氨酸能够改善梗阻性黄疸肝脏组织结构的损害，减少肝细胞的凋亡，发挥一定的保护作用。这可能是通过上调肝脏组织Bcl-2蛋白表达，下调肝脏组织Bax蛋白的表达来实现的。【参考文献】　　[1] Kurosawa H， Que FG， Roberts LR， et al. 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