阻断糖尿病小鼠共刺激分子延长异种胰岛移植细胞功能
发表时间：2010-02-04 浏览次数：628次
阻断糖尿病小鼠共刺激分子延长异种胰岛移植细胞功能作者：尹朝晖，张敬成，权燕 作者单位：汕头大学医学院第一附属医院 普外科，广东 汕头 515041 【摘要】 目的 阻断多种共刺激分子而诱导免疫耐受，以延长移植到糖尿病小鼠体内的猪胰岛细胞的功能。方法 将猪胰岛细胞移植于链脲佐菌素诱导的雄性C57BL/6糖尿病小鼠左肾被膜下，应用CTLA-4Ig融合蛋白、抗LFA-1抗体和抗CD40L抗体阻断多种共刺激分子，观察移植效果及移植物存活时间。结果 猪胰岛细胞移植后可降低糖尿病小鼠血糖；与对照组相比，实验组胰岛细胞存活时间明显延长。结论 应用CTLA-4Ig融合蛋白、抗LFA-1抗体和抗CD40L抗体可延长异种移植胰岛细胞存活时间。 【关键词】 胰岛移植；CTLA-4Ig融合蛋白；抗LFA-1抗体；抗CD40L抗体 Blockade of co-stimulatory receptor in diabetic mice to prolong the function of porcine islet xenograft YIN Zhaohui，ZHANG Jingcheng， QUAN Yan.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Medical College， Shantou University， Shantou， Guangdong 515041 Abstract Objective To blockade co-stimulatory receptors in diabetic mice for inducing the immune tolerance for prolonging the survival of porcine islet xenografts. Methods The porcine islets were transplanted beneath the left kidney capsule of male diabetic C57BL/6 mice induced by intravenous injection of STZ， and the diabetic mice were treated with CTLA-4Ig， anti-CD40L and anti-LFA1 antibodies to blockade the co-stimulating pathway. The survival and functions of porcine islet xenografts were observed. Results Euglycemia could be achieved in diabetic mice after xenografted porcine islet was transplantation. Compared with the controls， the survival of islet xenografts was prolonged in treated group. Conclusion Combined CTLA-4Ig， anti-CD40L and anti-LFA1 therapy can prolong survival time of porcine islet xengraft in mice. Key words islet transplantation； CTLA-4Ig； anti-CD40L antibody； anti-LFA1 antibody 应用胰岛细胞移植治疗1型糖尿病已取得良好临床效果[1]，但人胰岛细胞来源不足限制了其在临床上的广泛应用；异种（尤其是猪）胰岛细胞被认为是理想来源之一，然而异种移植排斥反应影响了其应用。研究表明共刺激途径（costimulatory pathway）在异种胰岛移植排斥反应中起重要作用[2-5]，本研究应用CTLA-4-Ig融合蛋白、抗LFA-1抗体和抗CD40L抗体阻断共刺激分子以延长移植到糖尿病小鼠体内的猪胰岛细胞的存活期。现报告如下。1 材料和方法 1.1 实验设计 诱导成模的雄性C57BL/6糖尿病小鼠（20~24 g）作为移植受体，随机分为三组；Ⅰ组为治疗组(n=8)：腹腔分别注射0.5 mg CTLA-4Ig、0.5 mg抗LFA-1抗体和0.2 mg抗CD40L抗体（瑞典胡丁医院临床外科中心提供），并行左肾被膜下移植5 μl(4000 islet equivalents，IE) 猪胰岛细胞；Ⅱ组为移植对照组(n=5)：腹腔分别注射0.5 mg CTLA-4Ig、0.5 mg抗LFA-1抗体和0.2 mg抗CD40L抗体，左肾被膜下注射生理盐水；Ⅲ组为空白对照组(n=7)：生理盐水腹腔注射，并左肾被膜下猪胰岛细胞移植。尚设正常空白对照Ⅳ组(n=3)：正常雄性C57BL/6小鼠，给予生理盐水替代链脲佐菌素，腹腔分别注射0.5 mg CTLA-4Ig、0.5 mg抗LFA-1抗体和0.2 mg抗CD40L抗体，左肾被膜下注射生理盐水。 移植当日给予注射相应试剂，以后每8天重复腹腔注射1次；移植后第1周每日应用快速血糖仪测鼠尾血1次，以后每2~3天测1次，共观测4周；期间若连续2次血糖超过20 mmol/L，并有体质量减轻，同时病理检查移植物周围有淋巴细胞浸润，则视为出现排斥反应而治疗失败；观测4周后，行葡萄糖耐量试验并切除肾移植物，两日后再连续测血糖2次。 1.2 猪胰岛细胞的制备 切取成年杂种猪（200~300 kg）胰腺，参照Rocordi方法[6]，应用0.5 g/L胶原酶P（Roche Diagnostics GmbH公司）消化胰腺组织，后经Ficoll（Sigma公司）密度梯度离心纯化收集胰岛细胞，悬于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，置CO2培养箱培养。移植前，应用ApoGrow BioAssay试剂盒（Cambrex Bio Science Rockland 公司）检测胰岛细胞活性。 1.3 糖尿病模型的制备 雄性C57BL/6小鼠经尾静脉注射链脲佐菌素（STZ，Sigma 公司）250 mg/kg，注药后第2~4天每日检测1次鼠尾血血糖值，连续2次空腹血糖超过20 mmol/L为成模。 1.4 肾被膜下胰岛细胞移植 异氟醚持续吸入麻醉后，剃除受体小鼠左背部毛发并消毒，切开左肋脊角处皮肤，用微型电刀切开相关肌层，显露左肾，于左肾偏上极被膜下注射5 μl(约4 000 IE) 猪胰岛细胞，略压迫防止外溢，5-0 prolene线缝合肌层和皮肤；术后经阴茎背血管给予少量抗生素以预防感染。 1.5 葡萄糖耐量试验 Ⅰ组中的小鼠在移植后第4周时给予腹腔注射葡萄糖（0.5 mg/g），之后于第10、20、30、45、60、75和90 min检测血糖变化。 1.6 左肾移植物的切除 Ⅰ组中的小鼠在移植后第28天于持续吸入麻醉下，切开左肋脊角处皮肤、皮下、肌层，分离暴露左肾上极，被膜下移植物呈灰白色，用微型电刀切除。 1.7 统计学方法 PRISM 3.0软件(GraphPad公司，USA)用于数据分析，所有数据均以均数±标准差表示；两组间比较应用Student’s t检验，P<0.05有统计学意义。2 结果 2.1 一般情况 实验小鼠中未有因手术操作引起的死亡。移植后1周，Ⅰ组小鼠体质量较术前增加（23.3±0.5 vs 21.6±0.5 g，P=0.03，n=8），Ⅱ组小鼠较术前降低（20.4±0.5 vs 22.4±0.5 g，P=0.02，n=5），Ⅲ组中无明显增加（21.43±1.3 vs 22.0±0.5 g，P=0.69，n=7）。 2.2 培养的胰岛细胞 用于移植的猪胰岛经检测，其ADP/ATP比值小于0.12，表明猪胰岛细胞活性良好。 2.3 移植物存活期 接受猪胰岛细胞移植的糖尿病小鼠，无论是Ⅰ组还是Ⅲ组，血糖在移植后第1天就开始较移植前明显下降，而Ⅱ组、Ⅳ组血糖无明显降低；Ⅲ组（n=7）中在胰岛移植后第6~11天出现排斥反应，移植物存活期为（8.1±1.7）d，而Ⅰ组（n=8）中除2例分别于移植后第7日和第13日出现排斥反应，1例在第23天因尾部损伤退出实验，余5例在观察期间（28 d）未出现排斥反应（见图1）。 2.4 葡萄糖耐量试验 3只Ⅰ组糖尿病C57BL/6小鼠和2只正常C57BL/6小鼠参与此试验；与正常小鼠相比较，Ⅰ组中血糖的峰值出现于10 min，无明显延迟，但峰值较正常降低（见图2）。 左肾移植物切除后，血糖较切除前明显升高，说明切除前的血糖降低是由于移植了异种胰岛所致，而非自身胰岛细胞功能自发恢复。3 讨论 能否克服异种移植物激发的排斥反应发生是移植成功的关键。研究表明，猪胰岛细胞-小鼠移植模型的排斥反应主要是以CD4+ T细胞介导的免疫反应；而T细胞完全活化不仅需要TCR-抗原肽-MHC分子复合物传递的第一信号，还需T细胞与APC表面的共刺激分子相互作用传递的第二信号，只有双信号同时识别，T细胞才能从G0期进入G1期，然后进入细胞循环增殖阶段。缺乏共刺激信号时可致T细胞无反应性或诱导细胞凋亡，因此通过阻断T细胞活化的共刺激途径诱导耐受成为研究的一个热点[2-5]。 迄今为止，已发现多种共刺激分子。CD28/B7是最重要的第二信号，CTLA-4分子与CD28高度同源，CTLA-4与B7结合可抑制T细胞活化。通过将CTLA-4的胞外部分融合到IgG重链恒定区构建的重组CTLA-4Ig融合蛋白，能以更高的亲和力与B7分子结合，阻断CD28/B7途径而抑制T细胞的活化。研究表明，CTLA-4Ig治疗可诱导异种胰岛移植的供体特异性耐受，而延长移植的异种胰岛细胞存活期[7-8]。 CD40/CD40L是另一对重要的共刺激分子，CD40主要表达与B细胞、滤泡状树突细胞和单核细胞表面，而CD40L主要分布在CD4+ T细胞表面。Appel等[9]应用抗CD154单克隆抗体选择性阻断CD40/CD40L（CD154）共刺激通道，可使40%移植了胎猪胰岛糖尿病小鼠体内的移植物生存期明显延长，并可纠正高血糖。 LFA-1是一种β-2整合素，表达于T细胞和其他几乎所有的淋巴组织及淋巴样组织细胞上，其是加强T细胞与Ag-MHC相互作用的黏附分子，在CD4+、CD8+ T细胞增殖及CD8+ T细胞介导的细胞毒反应中起着核心作用，是另一共刺激分子。应用抗LFA-1单克隆抗体短期治疗可有效延长同种异体或异种移植的胰岛细胞的生存时间[10-12]。 研究亦表明，单一阻断某一共刺激分子难以取得长期稳定的疗效，联合应用两种或以上具有阻断共刺激信号转导作用的分子可提高受体对移植物的耐受，进而延长同种异体或异种移植的存活期，同时也提高移植物的治疗效率[4，11-13]。 本研究应用CTLA-4Ig融合蛋白、抗LFA-1抗体和抗CD40L抗体阻断CD28/B7、LFA-1和CD40/CD40L共刺激途径，结果表明联合治疗可使87.5%糖尿病小鼠体内的猪胰岛细胞的存活期延长(>11 d)，同时移植的异种胰岛可发挥稳定的功能，降糖效果迅速且持久，葡萄糖耐量试验也无明显吸收高峰延迟。我们也注意到在联合治疗组发生的两例排斥反应皆出现于移植后2周内，且其降糖效果起伏；其余6例的降糖效果则相对平稳，且相对持久；这是否提示在应用阻断共刺激途径的方法诱导移植耐受时，早期的诱导尤为重要，且早期移植物的疗效也可能预示了诱导耐受程度及其远期效果。另外，本实验的观察期仅4周，故尚无法对此联合疗法长期效果作出评估。 理论上，本研究阻断3个不同的共刺激途径而诱导了较满意的耐受效果，但本实验及相关的预实验表明联合治疗的治疗效果并非单一治疗效果的累加，联合治疗的共刺激分子的选择及其诱导的耐受程度尚需大量的实验研究。【参考文献】 [1] Shapiro AM， Lakey JR， Ryan EA， et al. 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