CCl4慢性肝损致无白蛋白受体鼠对移植骨髓细胞肝细胞增殖的影响

CCl4慢性肝损致无白蛋白受体鼠对移植骨髓细胞肝细胞增殖的影响作者：夏焱，姜波健，俞继卫，张彪，李锋    作者单位：上海交通大学医学院附属第三人民医院 普外科，上海 201900 上海市卫生局基金资助项目（2008143）    【摘要】  目的 观察和研究F344来源的骨髓细胞（bone marrow cells，BMCs）能否驻存于γ-全身照射的先天性无白蛋白大鼠的骨髓，进而转化为产白蛋白肝细胞，移植后给予四氯化碳（carbon tetracholoride，CCl4）后对这些细胞增殖的影响。方法 雄性F344大鼠为供体，而雄性F344alb（先天性无白蛋白大鼠）为受体，分为4组：组Ⅰ（n＝10）为正常对照组，不接受肝损处理，无全身射线照射和阴茎静脉骨髓细胞移植；组Ⅱ（n＝10）为肝损无移植组，只接受肝损处理，无全身射线照射和阴茎静脉骨髓细胞移植；组Ⅲ（n＝10）为正常移植组，全身射线照射后阴茎静脉移植骨髓细胞1×107；组Ⅳ（n=10）为肝损移植组，接受CCl4注射肝损，全身射线照射后阴茎静脉骨髓细胞移植1×107 BMCs，其中，γ-照射剂量为7.5 Gy，F344大鼠的BMCs经受体的阴茎静脉注入。移植后四周，CCl4腹腔内注射铸成大鼠慢性肝损模型，细胞移植12周后，处死大鼠。肝脏切片用抗白蛋白抗体行白蛋白免疫染色，检测从受体骨髓细胞和肝脏切片中呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA和血清中白蛋白的水平。结果 ①尽管组Ⅰ肝脏切片可发现少量散在的1个或2个白蛋白阳性肝细胞，但是白蛋白阳性肝细胞呈多于6个的簇状分布仅发现于γ射线全身照射后接受BMCs移植的肝切片中（组Ⅲ和组Ⅳ），而且组Ⅳ中呈多于6个的簇状分布的肝细胞数明显多于组Ⅲ，有统计学意义。②从F344alb 受体（组Ⅲ和组Ⅳ）骨髓细胞及肝脏切片中微切的呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA中可检测到正常的白蛋白基因序列。③组Ⅳ较组Ⅲ血清中白蛋白水平显著升高。结论 ①F344来源的骨髓细胞移植入全身射线照射的F344alb 受体，可驻存于F344alb 受体的骨髓内，进而转化为产白蛋白的肝细胞。②F344来源的骨髓细胞移植入全身射线照射的F344alb受体，4周后CCl4腹腔内注射铸成大鼠慢性肝损模型可明显增加骨髓细胞的增殖。③全身射线照射后移植F344供体骨髓细胞，之后CCl4腹腔内注射铸成大鼠慢性肝损模型的F344alb受体的外周血中白蛋白水平可明显提高。    【关键词】  骨髓细胞；移植；肝细胞；先天性无白蛋白；白蛋白；基因；γ-全身照射；四氯化碳；大鼠    Effect of analbuminemic recipient rats resulted from chronic hepatic damage caused by CCl4 on the proliferation of hepatocyte derived from bone marrow cells transplanted into the analbuminemic rats     XIA Yan，JIANG Bojian，YU Jiwei，et al.　Dept of General Surgery， NO.3 People’s Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 201900 　　Abstract   Objective  To observe and investigate whether BMCs derived from F344 can harbor in the bone marrow cells (BMCs) congenic Nagase’s analbuminemic rats (F344alb) recipients who had undergone γ-irradiation and can further raise albumin-producing hepatocytes in the liver. Methods  Six weeks old male Fischer 344 rats (F344) were used as donors， and six weeks old male F344alb as recipients. All F344alb were divided into 4 groups： group Ⅰ (n=10) was untreated； group Ⅱ (n=10) was treated with CCl4 but no γ-irradiation and transplantation； group Ⅲ (n=10) was transplanted with 1×107 BMCs after γ-irradiation， but without CCl4 treatment； group Ⅳ (n=10) was transplanted with 1×107 BMCs after γ-irradiation， with CCl4 treatment. The BMCs prepared from the donors were infused via the penial veins of recipients immediately after whole body γ-irradiation (7.5 Gy) and CCl4 treatment： 4 weeks after BMCs transplantation， CCl4 were injected into peritoneal cavity twice a week for 4 weeks. Animals were sacrificed in the 12th weeks after transplantation. Slices of the liver were stained by albumin immunostaining with anti-rat albumin antibody. DNA extracted from BMCs and dissected alb+ clusters consisting of more than 6 alb+ hepatocytes as well as serum albumin levels of recipients were examined. Results  ①Although single or double cells of albumin positive (alb+) hepatocytes were seen in the livers of untreated F344alb (group Ⅰ)， clusters consisting of more than 6 alb+ hepatocytes were only detected in the livers of recipients that received transplantation of BMCs after γ-irradiation with or without CCl4 liver damage (group Ⅲ and Ⅳ). ②The normal gene sequence of albumin was detected in BMCs of F344alb recipients and dissected alb+ clusters consisting of more than 6 alb+ hepatocytes in F344alb transplanted with BMCs after γ-irradiation (group Ⅲ and Ⅳ). ③Serum albumin levels of F344alb recipients in group Ⅲ and Ⅳ were significantly increased. Conclusion  ①These findings indicate that BMCs can harbor in BMCs of the F344alb recipients γ-irradiated and further more can raise albumin-producing hepatocytes in the liver. ②After BMCs transplantation， liver damage by CCl4 can indeed promote the proliferation of the BMCs in liver.　　Key words  bone marrow cells； transplantation； hepatocytes； analbuminemic； albumin； gene； γ-whole body irradiation； carbon tetracholoride； rats　　肝脏疾病是危害人类健康的一类重要疾病。目前，干细胞移植的研究是热点，也为肝病的治疗带来了新的希望。本研究应用骨髓细胞移植技术，通过移植后的肝损模型，期望发现并证实移植后的骨髓细胞增殖条件，为骨髓细胞移植的临床应用提供实验依据。1  材料和方法　　1.1 动物处理 　　雄性F344大鼠购自日本横滨（Yokohama，Japan），而F344alb则由日本旭川医科大学动物试验室培育。6到7周龄的雄性F344大鼠作为供体，同时6到7周龄的雄性F344alb大鼠作为受体。分为4组：组Ⅰ（n＝10）为正常对照组，不接受肝损处理，无全身射线照射和阴茎静脉骨髓细胞移植；组Ⅱ（n＝10）为肝损无移植组，只接受肝损处理，无全身射线照射和阴茎静脉骨髓细胞移植；组Ⅲ（n＝10）为正常移植组，全身射线照射后阴茎静脉移植骨髓细胞1×107；组Ⅳ（n=10）为肝损移植组，接受CCl4注射肝损，全身射线照射和阴茎静脉骨髓细胞移植1×107 BMCs，其中，γ-照射剂量为7.5 Gy，F344大鼠的BMCs经受体的阴茎静脉注入。移植后四周，四氯化碳（carbon tetracholoride，CCl4）腹腔内注射铸成大鼠慢性肝损模型，细胞移植12周后，处死大鼠。肝脏切片用抗白蛋白抗体行白蛋白免疫染色，检测从受体骨髓细胞和肝脏切片中呈多于6个白蛋白阳性簇状分布的肝细胞群中提取的DNA和血清中白蛋白的水平。　　1.2  供体骨髓细胞的制备 　　取出供体的股骨，用18号注射针头以含有4%胎牛血清的DMEM液（Dulbecco’s modified Eagle medium，Gibco-BRL，Grand-Island，NY）冲洗骨髓腔，经离心后用Histopache提取骨髓细胞，用血细胞计数片计数细胞数，锥虫蓝染色测活率85%以上。　　1.3  白蛋白的免疫染色 　　肝脏用PLP（periodate-lysine-paraformaldehyde solution）经门静脉灌流[1]，组织切片后浸泡于PLP中过夜，经梯度的酒精处理再石蜡包埋。组织切成3 ?滋m的薄片，经下述处理：脱蜡，浸泡于3% H2O2 5 min，与1/800稀释的兔抗大鼠抗体（Cappel，Malvern，PA）孵育，再与辣根过氧化酶偶联的山羊抗兔IgG 多聚物（Dako，CA）孵育，经PBS（phosphate-buffered saline）漂洗后用DAB底物（Dako）显色，再用苏木精复染。白蛋白染色阳性的肝细胞分成4种：单个细胞阳性，两个细胞阳性，3~5个细胞阳性，≥6个细胞阳性。显微镜下白蛋白染色阳性细胞计数，用Scion Image软件计算出每平方厘米白蛋白染色阳性细胞数。　　1.4  PCR检测白蛋白的基因序列 　　从F344alb大鼠骨髓细胞中提取DNA，PCR 条件：38个循环，94℃30 s， 58℃ 30 s和72℃ 1 min。引物序列， 5′-GAAGGCGATCCTCCTGCCTGC-3′(forward)及5′-CCACCGTGAGTGTTCCTAGC-3′(reverse)， 引物的设计是为了扩增F344alb 白蛋白基因中内含子7个碱基对的缺失[1]。PCR产物在10%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，溴化乙锭染色，然后在紫外线下照相。　　1.5  微切 　　在白蛋白免疫染色切片上用激光捕获微切系统（Olympus，Tokyo，Japan）取到白蛋白染色阳性细胞群，与蛋白K液（500 ?滋g/ml）37℃温育2 h，再95℃温育30 min，然后两次PCR，条件：38个循环，94℃ for 30 s，58℃ 30 s和 72℃ 1 min。引物序列，5′-GAAGGCGATCCTCCTGCCTGC-3′(forward)及5′-CCACCGTGAGTGTTCCTAGC-3′(reverse)。　　1.6  Western blotting 　　大鼠处死时采血，分离血清并储存于-80℃冷冻箱中。100 ?滋g的血清样品在蛋白处理液中煮沸5 min后在13%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到硝酸纤维素薄膜(Hybond ECL，Amersham)上，薄膜在5%无脂奶PBS与0.2% Tween 20 混合液中4℃孵育过夜，室温下与1/5000稀释的兔抗大鼠白蛋白抗体孵育1 h，二抗为辣根过氧化酶偶联的驴抗兔抗体(Dako，CA)，1/8000稀释。最后用ECL(Amersham)系统检测。　　1.7  统计学方法 　　用单因素方差分析（Oneway ANOVA）来检验各组间差异，数据以x±s表示，用SPSS 10.0 统计分析软件包进行分析，检验水准ａ=0.05。2  结果 　如图1所示，尽管对照组（组Ⅰ）肝脏切片可发现少量散在的1个或2个白蛋白阳性肝细胞，但是白蛋白阳性肝细胞呈多于6个的簇状分布仅发现于γ射线全身照射后接受BMCs移植的肝切片中（组Ⅲ和组Ⅳ），而且组Ⅳ中呈多于6个的簇状分布的肝细胞数明显多于组Ⅲ，有统计学意义（见表1），说明先天性无白蛋白大鼠γ射线全身照射后接受BMCs移植后腹腔注射CCl4制成慢性肝损模型与无慢性肝损相比， 确能增加供体骨髓细胞来源转化成白蛋白染色阳性的肝细胞。　　用PCR 扩增含7 bp缺失的白蛋白基因序列，发现：F344alb的骨髓细胞提取的DNA仅出现60 bp的条带，而F344则出现67 bp的条带，在γ射线全身放射后即进行BMCs移植的F344alb大鼠骨髓细胞DNA PCR结果均发现了67 bp的条带，由此证实了供体来源的细胞在受体骨髓内的驻存，见图2。　　在白蛋白免疫染色切片上用激光捕获微切系统取到白蛋白染色阳性细胞群，经与蛋白K液温育后，两次PCR后电泳结果显示：这些呈簇状分布的白蛋白染色阳性细胞群的DNA经扩增后显示了67 bp的条带，说明这些细胞是供体来源，见图3。　　Western blotting印迹分析(见图4)：在对照组F344alb和无骨髓细胞移植而仅有慢性肝损的F344alb可发现极少量的白蛋白 (组Ⅰ和组Ⅱ)。而在BMCs移植的F344alb(组Ⅲ)和BMCs 移植后给予慢性肝损的F344alb(组Ⅳ)中可发现白蛋白水平的显著提高，其中组Ⅳ白蛋白水平显著升高。3 讨论　　许多研究已经显示大鼠或小鼠照射后移植骨髓细胞后可重建骨髓功能[2]。Theise等[2]将正常雄性小鼠骨髓移植到正常雌性小鼠体内，应用荧光原位杂交方法检查小鼠肝脏细胞Y染色体，结果发现雌性小鼠肝脏的部分肝细胞表达Y染色体，提示骨髓干细胞在正常肝脏环境中能分化为肝细胞。Petersen等[3]将雄性大鼠骨髓细胞移植到肝损伤且肝细胞增殖被抑制模型的雌性大鼠体内，发现该模型雌性大鼠肝脏中部分细胞表达Y染色体，且Y染色体阳性细胞亦表达成熟肝细胞，提示骨髓干细胞在肝损伤且肝细胞增殖被抑制的肝脏中能分化为肝细胞。Lagasse等[4]将正常小鼠骨髓干细胞移植到延胡索酰己酰乙酸羟化酶基因缺陷小鼠中，观察模型小鼠的生长状况及其肝脏生化功能恢复情况，结果发现骨髓细胞中的HSC在体内转分化为肝细胞，使小鼠产生供体来源造血和肝细胞的再生，使受体小鼠肝脏的生化功能得以恢复。但到目前为止，鲜有用F344-F344alb 这种特殊的动物模型来观察骨髓细胞首先是否能驻存于受体的骨髓中，然后进一步转化成产白蛋白的肝细胞， 而且转化后的肝细胞如何实现增殖是大家关切的热点问题。所以本实验中使用了这种无白蛋白的特殊动物模型，不仅能通过正常白蛋白mRNA和蛋白的检测来识别供体来源的肝细胞，而且不需用免疫抑制剂使本实验简单易行。首先，我们在F344albγ射线全身照射后移植了F344的骨髓细胞后成功地获得了骨髓的重建，在F344alb中缺乏正常的白蛋白基因可在重建后的F344alb骨髓中检测到。PCR结果显示：除了检测到正常的67bp外还检测到了异常的60 bp的条带，就证实了F344albγ射线全身放射后移植了F344大鼠的骨髓细胞后重建骨髓的嵌和状态。其次，我们在BMCs移植后可检测到白蛋白染色阳性的簇状肝细胞。这些细胞被认为来源于供体骨髓细胞基于以下理由：①这些细胞经微切后，提取DNA后经两次PCR扩增后显示67 bp的条带，对这些细胞的来源提供了最有力、直接的证据。而67 bp的条带下方有一条淡淡的60bp 的条带，这可能是微切时混有少量F344alb非供体来源的肝细胞。②骨髓细胞移植后白蛋白染色阳性的细胞数大幅增加。③出现簇状白蛋白染色阳性肝细胞群。④血清中白蛋白水平明显增加，显而易见，F344来源的骨髓细胞移植后能在无白蛋白大鼠的肝脏中增加白蛋白染色阳性的肝细胞数， 更重要的是，本实验显示：F344来源的骨髓细胞移植后在腹腔注射CCl4造成慢性肝损，确能增加供体骨髓细胞来源转化成白蛋白染色阳性的肝细胞，此结果由免疫组化染色和Western blotting清晰显示，此结果对干细胞治疗有重要的指导意义，我们下一步研究将阐明此现象的分子水平的机制，弄清参与其中的激素和因子，及通过何种机制发挥作用。在干细胞治疗中我们可否用类似的激素和因子促进有治疗作用的干细胞的增殖，从而大幅提升治疗作用。　　最近的研究[5]报道骨髓细胞移植后所产生的肝细胞，其机制可能是骨髓细胞与成熟的肝细胞的融合。然而Jang等[6]的研究显示造血干细胞转化为肝细胞并没有融合。他们将造血干细胞与受损的肝细胞用一个屏障使之隔离进行体外培养，染色体分析及组织特异的基因和蛋白分析结果显示造血干细胞转化为干细胞并没有融合，而且微环境的变化是促成造血干细胞转化为肝细胞的关键。同样，Ishikawa等[7]和Newsome等[8]报道人类的脐索细胞转化为肝细胞时亦没有发生融合。 这些不一致的结果可能是：首先，融合可能是在特定的动物模型（如FAH缺乏的小鼠）中遗传发生改变的结果，而且许多供体的细胞并没有融合，提示可能是先发生了转化，然后再融合；其次，肝损害可能是在造血干细胞转化为肝细胞中起重要的作用。即使细胞融合是所有这一切的原因（目前还有争议，尚未统一），它也可因为遗传物质的转移而有望成为基因治疗的一种手段[9]。总之，在这个领域还有很多问题有待阐明，有待进一步去深入研究。在我们实验中同样不能确定这种转化是否是BMCs和肝细胞融合的结果[10-13]，尽管如此，通过我们的研究可以阐明：移植的BMCs能恢复无白蛋白大鼠的生理功能。　　总之，我们的研究显示F344大鼠的BMCs首先能驻存于γ射线全身照射过的F344alb的骨髓，并能进一步转化为产生白蛋白的肝细胞，而且骨髓细胞移植后再腹腔注射CCl4造成慢性肝损，确能增加供体骨髓细胞来源转化成白蛋白染色阳性的肝细胞，BMCs或许能成为临床治疗肝脏疾病的重要干细胞来源。【参考文献】　　[1] Mclean IW， Nakane PK. Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative[J]. Histochem Cytochem，1974，22（12）：1077-1083.　　[2] Theise ND， Badve S， Saxena R， et al. Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation-induced myeloablation[J]. Hepatology，2000，31（1）：235-240.　　[3] Peterson BE， Bowen WC， Patrene KD， et al. Bone marrow as a potential sourse of hepatic oval cells[J]. Science，1999，284（5417）：1168-1170. 　　[4] Lagasse E， Connors H， Al-Dhalimy M， et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo[J]. Nat Med，2000，6（11）：1229-1234.　　[5] Vassilopoulos G， Wang PR， Russell DW. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion[J]. Nature，2003，422（6934）：901-904.　　[6] Jang YY， Collector MI， Baylin SB， et al. Hematopoietic stem cells convert into liver cells within days without fusion[J]. Nat Cell Biol，2004，6(6)：532-539.　　[7] Ishikawa F， Drake CJ， Yang S， et al. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice[J]. Ann NY Acad Sci，2003，996：174-185.　　[8] Newsome PN， Johannessen I， Boyle S， et al. Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in the mouse liver with no evidence of cellular fusion[J]. Gastroenterology，2003，124(7)：1891-1900.　　[9] Aziz M， Alan W. Surgeon and stem cells： A pragmatic perspective on shifting Paradigms[J]. Surgery，2004，136(5)：975-981.　　[10] Kallis YN， Alison MR， Forbes SJ. Bone marrow stem cells and liver disease[J]. Gut，2007，56(5)：716-724.　　[11] Cantz T， Sharma AD， Jochheim-Richter A， et al. Reevaluation of bone marrow-derived cells as a source for hepatocyte regeneration[J]. Cell Transplant，2004，13(6)：659-666.　　[12] Menthena A， Deb N， Oertel M， et al. Bone marrow progenitors are not the source of expanding oval cells in injured liver[J]. Stem Cells，2004，22(6)：1049-1061.　　[13] Vig P， Russo FP， Edwards RJ， et al. The sources of parenchymal regeneration after chronic hepatocellular liver injury in mice[J]. Hepatology，2006，43(2)：316-324.