一种新的胆胰管穿刺注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型的研究

一种新的胆胰管穿刺注射法制作重症急性胰腺炎大鼠模型的研究作者：章忠渭，张启瑜，周蒙滔，刘纳新    作者单位：1.绍兴第二医院 普外科，浙江 绍兴 312000；2.温州医学院第一附属医院 普外科，浙江 温州 325000 【摘要】  目的 研究一种新的胆胰管穿刺注射法制作重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠模型。方法 60只Sprague-Dawley大鼠随机分成对照组（30只）和模型组（30只），采用新的胆胰管穿刺逆行胰胆管注射5％牛磺胆酸钠法（简称新的胆胰管注射法）诱导SAP大鼠模型。随后共分1、3、6、12、24 h 5个时间点，动态观察两组大鼠的死亡率、腹水量、血清淀粉酶、胰腺组织病理变化并作病理评分，以及肝、肾、心功能的变化。结果 模型组24 h死亡率为16.67％。各时点，模型组腹水量、血清淀粉酶、谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、心肌型肌酸激酶同工酶值及胰腺组织病理评分均高于对照组（P<0.05），且各项数值呈一稳定的动态变化。结论 这种新的胆胰管穿刺注射法是一种操作简单，病变符合临床特征较为稳定的SAP大鼠模型制作方法。 【关键词】  重症急性胰腺炎；模型，动物；胆胰管；穿刺；大鼠   The research of a new method of puncturing biliopancreatic duct injection on rat model with severe acute pancreatitis　ZHANG Zhongwei， ZHANG Qiyu，ZHOU Mengtao， et al. Department of General Surgery， the Second Hospital of Shaoxing， Shaoxing， Zhejiang 312000　　Abstract  Objective  To study a new method of puncturing biliopancreatic duct injection on rat model with severe acute pancreatitis (SAP). Methods  Sixty SD rats were randomly divided into two groups： the SAP group （n=30） and the control group （n=30）. The SAP model was induced by the new method of retrograde injection of 5% sodium taurocholate into biliopancreatic duct after biliopancreatic duct punctured (to be abbreviated as the new method of puncturing biliopancreatic duct injection). All animals were sacrificed at 1， 3， 6， 12， 24 hours， respectively， after the onset of induction. Then rat mortality， ascites volume， serum amylase and function of liver， kidney， heart were examined in each group. Histological change of pancreas was also evaluated. Results  The mortality of SAP group at 24 hours was 16.67%. Levels of ascites volume， serum amylase (AMY)， alanine aminotransferase (ALT) ， blood urea nitrogen (BUN)， MB isoenzyme of creatine kinase (CKMB) and histological scoring in SAP group were all significantly higher than those of the control group at each time point （P<0.05). And data were in stabile kinetic variance. Conclusion  The new method of puncturing biliopancreatic duct injection can establish a simple and reliable SAP with clinical pathogenesis on rats.　　Key words  severe acute pancreatitis； model， animals； biliopancreatic duct； puncturing； rats　　临床重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)因其除了胰腺自身发生出血、坏死、白细胞浸润等病理改变外，往往伴有心、肺、肝、肾等多脏器功能损伤，从而导致较高的死亡率。因此建立一种病变符合临床特征、稳定的重症急性胰腺炎大鼠模型，对于重症急性胰腺炎及其并发症的发病机制、治疗研究起了至关重要的作用。本实验旨在总结前人制作大鼠SAP动物模型的基础上，探索一种操作简单，病变符合临床特征，而又稳定的重症急性胰腺炎大鼠模型制作方法。1  材料和方法　　1.1  动物分组 　　清洁级健康雄性SD大鼠60只，质量200~240 g，温州医学院动物中心提供，随机分成对照组（C组）和模型组（SAP组），每组按1、3、6、12、24 h各6只。　　1.2  动物模型制作方法 　　术前大鼠禁食12 h，自由饮水。2％戊巴比妥钠（剂量60 mg/kg），腹腔注射进行麻醉，大鼠麻醉后，剑突下正中切口进入腹腔，暴露十二指肠和胰头部，确认胆胰管及肝门部胆总管。手术灯光下，胆胰管呈灰白色直径约1 mm的细管状，全长被粉红色的胰腺组织所包绕，且其并非垂直开口于十二指肠，而是先在系膜缘肠壁内向肠远端斜行约3~5 mm后，通过膨大成喇叭形的十二指肠乳头开口于十二指肠降部。用左手食指垫起十二指肠降部，在灯光透视下顺着胆胰管走向仔细辨认肠管壁内潜行的灰白色喇叭形乳头，于其开口略偏下对系膜缘肠壁上选一无血管区，用5号皮试针头戳一小孔，当针尖进入肠腔后，有一明显突破感。通过此孔置入一钝头5号皮试针（由5号皮试针头在砂轮上磨平针尖而成），针管前端贴着系膜缘肠壁向乳头开口方向缓慢滑行，滑行过程中持针的右手有一定的阻力感，当经乳头开口探入胆胰管内的一瞬间，阻力感完全消失。顺其走行继续推进约8~10 mm后，用两枚显微血管夹临时夹住胆胰管穿刺针处，同时用一枚显微血管夹临时夹住肝门部胆总管，以防注射牛磺胆酸钠时液体流入十二指肠和肝内胆管。用1 ml注射器以0.05 ml/min匀速向胆胰管内推注5％牛磺胆酸钠（剂量1 ml/kg）。注射完毕后，撤去针头，继续阻断胆胰管上下端5~10 min，观察到胰腺出现明显充血、水肿，点状或片状出血后（见图1），移去显微血管夹。用6个“0”丝线荷包缝合肠壁穿刺孔，逐层关腹。与模型组相比，对照组只行经十二指肠乳头逆行胆胰管穿刺一次，未向胆胰管内注射任何液体。大鼠术后均皮下注射生理盐水20 ml/kg，以补充术中丢失水分，并分笼安置大鼠，禁食，不禁水。　　1.3  观察指标 　　术后观察大鼠生存状态，统计各组死亡率。分别按1、3、6、12、24 h将存活大鼠麻醉后开腹，采集腹水量，并经下腔静脉采血留取血清，全自动生化分析仪测定血清淀粉酶（AMY）、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、心肌型肌酸激酶同工酶(CKMB)。取胰腺标本予10％福尔马林固定后制作石蜡切片，进行光镜病理组织学观察，并按照Schmidt[1]评分标准进行病理严重度分析。　　1.4  统计学方法　　采用SPSS软件，数据以x±s表示。两组均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　　2.1  两组大鼠生存状态、死亡率、腹水指数和血清淀粉酶水平变化及Schmidt评分 　　麻醉清醒后，模型组大鼠与对照组相比，精神状态差，活动明显减少。SAP 24 h组于术后12~24 h死亡1只，其余各组均无死亡。模型组各时间点腹水量、血清淀粉酶水平及胰腺组织Schmidt评分均明显高于对照组（P<0.05），且各项数值呈一稳定的动态变化。具体见表1。　　2.2  胰腺大体病理学改变 　　SAP组术后1 h：胰腺充血水肿体积增大，散在片状出血改变，腹腔可见少量淡红色腹水；术后3 h：胰腺轮廓模糊，呈黏冻状出血改变，腹腔有中等量浅红色腹水；术后6 h：胰腺轮廓不清，广泛出血，可见散在分布的暗红色点灶状坏死；腹腔可见多量暗红色腹水；肠系膜、大网膜上散在皂化斑。术后12 h：胰腺轮廓消失，可见广泛分布的暗红色出血坏死灶；腹腔可见大量血性腹水，胰腺、胰周及肠系膜、大网膜上有较多皂化斑(见图2)。术后24 h：胰腺组织广泛淤血坏死，可见囊肿，腹腔内充满血性腹水、大量皂化斑，并可见不同程度的胃肠胀气。对照组术后各时间点胰腺组织呈淡粉红色，均匀一致，光泽度好，未见明显腹水及皂化斑。　　2.3  胰腺组织镜下病理学改变　　SAP组：胰腺组织水肿明显，小叶间隙增大，其间充斥大量淡红色渗出物，腺泡细胞肿胀，部分腺泡呈孤岛状；可见坏死灶，坏死区内腺泡结构紊乱，腺泡细胞结构消失，胞核发生凝固、碎裂、溶解，胞膜破裂，最后呈均一红染状；血管及腺泡细胞周围散在炎症细胞（包括单核巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）以及红细胞；间质内可见坏死的脂肪细胞轮廓，微血管破裂，其周围大量红细胞、白细胞溢出。上述病变严重程度随造模后时间延长而加重（见图3）。对照组：除胰腺腺泡细胞水肿外，小叶结构清晰，未见明显出血坏死，偶见间质内炎症细胞浸润。　　2.4  两组大鼠肝、肾、心功能指标变化 　　各时点，模型组血清谷丙转氨酶、尿素氮、心肌型肌酸激酶同工酶检测结果均显著高于对照组（P<0.05），且各项数值呈一稳定的动态变化（见表2）。3  讨论　　Aho等[2]于1980年首创胆胰管穿刺注射法，是目前运用较为广泛的一种模型，该模型的致模因素与临床相似，模拟胰管梗阻、胆汁反流等病因造成急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）[3]。实验过程中，通过改变注射速度、注射持续时间、药物浓度可以产生轻重不同的AP模型，能较好地控制AP病变程度，也适合评价药物的疗效。但该模型制作过程中，需切开十二指肠外侧壁，并用注射针穿刺经过十二指肠内侧壁至胆胰管进行模型诱导，上述操作易引起十二指肠内侧壁胰头缘血管的损伤而大出血，模型诱导后胆胰管内牛磺胆酸钠易经胆胰管穿刺“假道”溢出而影响模型制作的成功率和稳定性。同时，由于大鼠肠壁薄，血供丰富，切开时易造成肠壁损伤，缝合时又易形成狭窄，人为地引起高位机械性肠梗阻；加之肠壁出血及胰腺炎本身大量的液体渗出，大鼠可因有效循环血容量不足而早期死亡[4]，使之病理生理过程与研究目的不符。　　为弥补Aho法的上述缺陷，我们通过总结前人制作SAP大鼠模型及自身实践的经验，在本实验中采用了一种新的胆胰管穿刺注射法制作SAP大鼠模型。我们认为运用该方法制备模型具有以下几个方面特点：①采用5号皮试针头在肠壁无血管区戳一小孔，与切开肠壁相比，既简化了操作又极大地减少了对肠壁的损伤。②十二指肠乳头是大鼠胆胰管汇合部下端的生理开口，采用钝头5号皮试针经此处穿刺，可以减少穿刺时对乳头及其周围肠壁组织造成的损伤，同时避免了因损伤胰头缘血管而引起的大出血，并且还避免了穿刺“假道”所引起的漏胆现象，从而提高了模型制备的成功率和稳定性。③由于大鼠的多条胰管在不同水平开口于胆胰管，且主胰管距乳头开口又较近，因此针头不宜置入过深，以免注药时分布不均，造成病变不均匀。④钝头5号皮试针细而光滑的特质确保了以最小的创伤使其达到成功插入胆胰管，但这一特质也造成了针和管之间留存有一定的空隙，为此我们用两枚显微血管夹夹闭胆胰管穿刺针处，从而在防止牛磺胆酸钠返流入肠道的同时又起到了固定针头的作用，并可简化操作，缩短手术时间。⑤由于牛磺胆酸钠注射模型的死亡率与药物注射压力有关，我们在实验中调整药物的注射速度至0.05 ml/min，以降低早期的死亡率。最后，肠壁穿刺孔处行浆肌层荷包缝合，避免了术后胆漏、肠漏的发生。⑥在熟悉大鼠十二指肠乳头解剖的基础上，并按照本实验的穿刺操作方法，可大大提高胆胰管穿刺的成功率，我们在实验中无一例因穿刺失误而导致模型制作失败，并且熟练掌握操作之后，大鼠模型制备时间可控制在15 min左右，减轻了创伤对实验数据的干扰。⑦各观察指标显示该法制备的模型符合重症急性胰腺炎血清淀粉酶升高、大量腹水、胰腺组织充血水肿、出血坏死炎性细胞浸润同时伴有多器管功能损伤的临床特征，而且腹水量、胰腺组织病理评分、血清生化指标呈一稳定的动态变化表明该模型具有可重复性和稳定性。模型组24 h死亡率为16.67％，其余各组均为0，说明该模型早期具有较长的存活时间。　　总之，运用这种新的胆胰管穿刺注射法制作SAP大鼠模型具有取材方便，操作简单、快捷，诱导成功率高，病变符合临床特征，早期较长存活时间，可重复性好而又稳定的优点，从而为重症急性胰腺炎及其并发症的发病机制、治疗研究提供较为可靠的动物模型。【参考文献】　　[1]Schmidt J. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg，1992，215(1)：44-49.　　[2]Aho HJ， Koskensalo SM， Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Sodium taurocholate-induced acute haemorrhagic pancreatitis[J]. Scand J Gastroenterol，1980，15(4)：411- 416.　　[3]Cosen-Broker LI， Binker MG， Negri G， et al. Acute pancreatitis possible initial triggering mechanism and prophylaxis[J]. Pancreatology，2003，3(6)：445-456.　　[4]王勇，刘志苏，江平，等. 两种逆行胆胰管穿刺方法复制胰腺炎模型比较[J]. 医学新知杂志，2002，12(2)：82-83.