缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性及细胞凋亡的影响

缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性及细胞凋亡的影响作者：庄永敬，曹云飞，吴桂荣，卢良声    作者单位：解放军421医院，广东 广州 510318；1.普外科，2.麻醉科 国家自然科学基金资助项目（C30000158）    【摘要】  目的 观察缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性、促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达以及肝细胞凋亡的影响，以进一步阐明肝脏缺血预处理的抗凋亡作用机制。方法 建立SD大鼠肝缺血（40 min）再灌注（120 min）损伤及肝缺血预处理的模型。24只大鼠随机分成3组（n=8）。①假手术对照组（C组），仅分离肝十二指肠韧带，不阻断肝门，不进行其他干预处理。②缺血再灌注组（IR组），在第一肝门用小血管夹阻断尾状叶及左肝叶血流40 min松开血管夹肝脏再灌注2 h，再灌注开始后关腹。③缺血预处理组（IP组），先行3个循环的缺血预处理，阻断第一肝门10 min，开放再灌注10 min为1个循环，随后操作同缺血/再灌注组。实验结束后全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶和血清谷丙转氨酶活性；TUNEL法检测肝组织的细胞凋亡指数（AI）；EMSA法测定肝组织核因子kB的结合活性；Western blotting免疫印迹法检测Fas及FasL蛋白的表达水平。结果 IR组和IP组的ALT、AST及细胞凋亡指数（AI）均明显高于S组（P<0.01），但与IR相比，IP组则明显较低（P<0.01）。与C组比较，IR组的核因子kB活性、促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达水平明显增高，而IP组仅轻度增高。结论 缺血预处理可通过降低肝脏缺血/再灌注早期核因子kB的转录活性，并下调促凋亡基因Fas及FasL的表达，从而发挥抗细胞凋亡和损伤保护效应。    【关键词】  缺血预处理；肝脏；再灌注损伤；核因子kB；凋亡；大鼠    Effects of ischemic preconditioning on cell apoptosis and the activity of nuclear factor-kappaB induced by hepatic ischemia-reperfusion injury in rats   ZHUANG Yongjing，CAO Yunfei，WU Guirong， et al. Department of General Surgery， PLA 421st Hospital， Guangzhou 510318 　Abstract   Objective  To explore the effects of ischemic preconditioning on cell apoptosis， activity of NF-kB， Fas and Fas-ligand expression induced by hepatic ischemia-reperfusion injury in rats， and to elucidate the underlying anti-apoptosis mechanism of ischemic preconditioning. Methods  Experimental models of hepatic ischemia-reperfusion injury were established in adult healthy SD rats， twenty-four rats were randomized into three groups (n=8). (1)Sham operation group， only hepatoduodenal ligament was separated， porta hepatis did not be blocked up， without carrying out other interventional treatments. (2)IR group： the blood of caudate lobe and left lobes of liver were blocked up for 40 minutes with small vessel clip at the first porta hepatis， then small vessel clip was taken away to recover liver reperfusion for 2 hours， at the same time， rat abdomen was closed. (3)IP group： the first porta hepatis was blocked up for 10 minutes followed by 10 minutes’ opening， referred to as a cycle， which was repeated for 3 times， sequent treatment was identical with I/R group． The level of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) in the serum of rats were detected with automatic biochemistry analyzer， the apoptosis index (AI) of hepatic cells was measured with TUNEL method， DNA binding activity of NF-kB in liver grafts was analyzed with EMSA (electrophoretic mobility shift assay)， and the Fas and Fas ligand expression in liver tissue was assessed with immunohistochemical method． Results  The levels of ALT， AST and AI were significantly higher in IR group and IP group than that in S group (P<0.01)， and remarkable higher were also observed in IR group than those in IP group (P<0.01). Compared with C group， activity of NF-kB， Fas and Fas-ligand expression were significantly increased in IR group， while only modest increase was observed in IP group． Conclusion  Ischemic preconditioning can relieve the liver cellular apoptosis by regulating the activity of NF-kB， Fas and Fas-ligand expression， which may play a pivotal role in the preservation of liver cells in IP protection effect．　　Key words   ischemic preconditioning； liver； reperfusion injury； nuclear factor-kappaB； apoptosis； rats　　缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）对肝脏缺血性损伤的保护作用已得到了较多的研究证实，但其内在的分子生物学机制仍不清楚[1-2]。我们的前期研究表明，缺血预处理对大鼠肝脏的早期缺血再灌注损伤具有明显的抗凋亡保护作用，其机制与抑制促凋亡基因的高表达有关[3]，但对于缺血预处理调控促凋亡基因表达的胞内信号转导通路则尚未阐明。鉴于核因子kB在肝脏的缺血/再灌注损伤以及细胞凋亡相关基因的转录调控中起了重要的作用[4-5]，推测核因子kB可能也是缺血/预处理抗肝细胞凋亡的重要作用靶位，但这一推测至今未得到证实。为此，我们拟通过观察缺血预处理对大鼠肝脏缺血/再灌注早期核因子kB活性、促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达以及肝细胞凋亡的影响，以进一步阐明肝脏缺血预处理的抗凋亡作用机制。1  材料和方法 　　1.1  材料 　　l0~l2周龄的健康SD大鼠24只，雌雄各半，质量240~280 g，由南方医科大学动物实验中心提供；Western LumiGlo试剂盒（美国Biolabs公司)；小鼠抗大鼠Fas及FasL抗体（美国Sigma公司）；辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG（美国Santa Cruz公司）；原位细胞凋亡试剂盒（POD）购自德国Boehringer Mannhein公司；BECKMAN自动生化检测仪（美国BECKMAN公司）。　　1.2  模型制作及分组 　　采用乙醚开放吸入麻醉，随机分3组（每组8只）。假手术组（control，C组）：大鼠成功麻醉，从尾静脉推注1 ml的肝素（50 U/ml）盐水。取上腹正中切口，进腹后分离肝十二指肠韧带，充分显露第一肝门部，但不阻断肝门，不施行缺血再处理和缺血/再灌注等处理。缺血再灌注组（IR组）：开腹显露第一肝门后，用无损伤血管阻断夹阻断左肝以及尾状叶的血管造成70％肝脏缺血，但不阻断右肝叶血流，以防门静脉和胃肠道瘀血。缺血时间40 min，再灌注时间120 min。缺血预处理组（IP组）：先行3个循环的缺血预处理（阻断第一肝门10 min，再开放10 min为1个循环)，随后的操作同IR组。　　1.3  血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化   　　采用BECKMAN自动生化检测仪检测血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性变化。　　1.4  肝细胞凋亡指数（HAI）的测定 　　采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的DUTP缺口末端标记法 (terminal deoxynucleotidyl transferase medicated d-UTP nick end labellng，TUNEL) 对肝凋亡细胞进行检测。按细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。每例标本的切片随机选取10个视野（×400），计算出平均每100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数表示作为肝细胞凋亡指数（hepatocyte apoptosis index，HAI）。凋亡细胞形态符合以下4点：单个细胞、周围无炎症反应、胞膜皱缩、胞核致密深染呈棕黄色颗粒。　　1.5  核因子kB结合活性的EMSA（electrophoretic mobility shift assay）测定  　　按我们既往已建立的EMSA法测定核因子kB结合活性[6]。提取左肝叶组织的核蛋白，置-70℃冻存备用。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用于核因子kB活性测定的两条寡核苷酸探针5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′及其互补链3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5′由Sangon生物工程有限公司合成，聚丙烯酰胺纯化后， 采用?酌[32P]ATP（北京亚辉生物工程公司）和T4多聚核苷酸激酶行5′末端标记，分装后置-20℃保存备用。结合反应总反应体积20 ul，分别加入20 ug核蛋白、2 ug poly(dI-dC)·poly(dI-dC)（Pharmacia Biotech公司）、4 ul 5×结合缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L NaCl，5.0 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L EDTA，5.0 mmol/L DTT，20%（V/V）甘油]，冰浴10 min后加入标记探针3 ul，于室温下反应20 min，4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(120 V×3 h)后，80℃干燥（BIO-RAD凝胶干燥器）1.5 h，-70℃放射自显影。　　1.6  Fas及FasL Western boltting蛋白印迹分析 　　取左肝叶组织约0.3 g加入细胞裂解液匀浆并裂解，用Sigma蛋白定量试剂作BSA蛋白定量，稀释各样品使蛋白含量在相同水平。取l0 ul样品上清液(含蛋白100 ug)，进行SDS-PAGE电泳。随后电转移至硝酸纤维素膜，分别与小鼠抗大鼠Fas及FasL抗体和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG反应，按Western LumiGlo显影系统试剂盒手册操作，X线胶片曝光、显像。　　1.7  统计学方法 　　各组数据均以x±s表示，采用SPSS10.0统计软件包进行t检验。2  结果 　　2.1  各组的血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性变化 　　与假手术组（C组）比较，缺血/再灌注组（IR组）和缺血预处理组的血清谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性显著增高（P<0.01）；但与IR组比较，IP组的谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性减低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。　　2.2  各组的肝细胞凋亡情况　　肝细胞凋亡指数（HAI）在IR组和IP组均明显高于S组（P<0.01），但IP组的HAI明显低于IR组（P<0.01），见表1。　　2.3  各组的核因子kB活性变化 　　EMSA测定显示假手术组肝组织中核因子kB的DNA结合活性较低，而在IR组肝组织中的NF-kB结合活性显著升高，但IP组肝组织的核因子kB结合活性仅轻度增加，见图1。　　2.4  各组的Fas及FasL蛋白表达情况 　　Western blot免疫印迹法检测显示，与C组比较，IR组的促凋亡基因Fas和FasL蛋白表达水平明显增高，而IP组仅轻度增高，见图2A和图2B。3  讨论　　肝脏的缺血/再灌注损伤（hepatic ischemia-reperfusion injury）多发生于外伤、失血性休克、肝切除手术和肝移植术后，是一种由诸多因素造成的复杂的病理生理过程。既往认为肝细胞坏死是缺血肝脏再灌注后细胞死亡的唯一方式，也是肝脏再灌注损伤的直接原因。但近年来的研究显示，肝脏缺血再灌注后的细胞死亡可以通过凋亡（apoptosis）和坏死两条途径表现出来。与细胞坏死不同的是，细胞凋亡是在自身基因调控下的一种细胞主动性自杀过程。因此，又被称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD)[1，7]。研究表明，细胞凋亡现象在肝脏的缺血/再灌注早期大量存在，并且是较短时间(<90 min) 肝脏缺血/再灌注后细胞死亡的主要方式和特征，而只有在更长时间的肝脏缺血才会表现出明显的肝细胞坏死现象[8]。因此我们采用了短时间肝脏缺血（40 min）再灌注模型，结果显示，缺血/再灌注早期（120 min）肝细胞凋亡（HAI）显著增加，肝功能（ALT和AST）明显受损，也证实细胞凋亡是肝脏短时间缺血/再灌注早期的主要特征，并且是导致再灌注损伤的直接原因。　　IP是近年来研究发现的一种对IR损伤的内源性保护机制，它通过一次或几次短暂的缺血/再灌注过程，可提高相应器官在长时间缺血及再灌注时间的耐受性。IP的保护作用在多种器官的缺血/再灌注损伤上已得到证实，肝脏也是其中之一，但其具体作用机制至今尚不明确，曾经提出的假设或推测包括有腺苷学说、线粒体ATP酶抑制学说、一氧化氮学说、蛋白激酶C学说等[2，9]。随着对肝脏缺血/再灌注期间细胞凋亡现象及其损伤作用研究的深入，IP的抗凋亡效应及其在改善肝脏缺血/再灌注损伤中的作用也得到了重视。本实验结果显示，IP处理能明显抑制由IR造成的肝细胞凋亡现象，并有效改善缺血肝组织的再灌注损伤，这一结果与我们的前期研究结果以及国内外的同类研究相符合[3，5，9]。但目前对于IP抗凋亡作用的具体机制尚不明确，多数观点认为，缺血预处理可通过调控细胞凋亡的信号转导通路而降低缺血再灌注对肝细胞的损伤，如调控凋亡相关基因Bcl-2、P53、bax、Fas，FasL、caspase-3等的转录表达[3，10]。我们的前期研究也证实IP的抗凋亡效应与其抑制促细胞凋亡基因表达有关[3]，但目前对于这些凋亡相关基因的胞内调控及上游信号转导机制并不清楚。　　核因子kB被认为是一种重要的转录因子，参与多种基因的表达及调控。近年来的研究显示，具有基因转录多向调控作用的核因子kB在肝脏的缺血/再灌注过程中起了非常重要的中心作用[11]。我们的前期研究证实，冷缺血肝组织中核因子kB在移植（热灌注）后早期诱导激活，并介导了诸多炎症介质以及黏附分子的过表达，而采用核因子kB抑制剂PDTC阻断其激活则可有效减轻肝脏的缺血/再灌注损伤，显示核因子kB是肝脏缺血/再灌注损伤过程中的一条转录主通道和防治新靶位[12]。进一步的离体研究表明，核因子kB是细胞程序性死亡或凋亡所必须的，核因子kB调控转录的许多靶基因都可诱导细胞凋亡，包括P53、c-myc、Fas/Apo-1连接蛋白、白介素转换酶等，核因子kB激活后可引起这些凋亡基因的转录[13]。鉴于Fas及FasL是介导细胞凋亡的重要通路，Fas及FasL相结合后可相继激活caspase-8、caspase-3，从而完成细胞程序性死亡信息的传递，我们推测核因子kB是在肝脏缺血/再灌注及预处理过程中调控促凋亡基因表达的重要转录因子。本研究观察到，与缺血/再灌注组相比，缺血预处理组核因子kB的活性和促凋亡基因Fas及FasL的表达均明显降低，且与细胞凋亡指数趋势一致，说明缺血预处理可通过抑制核因子kB的表达，并下调受其转录调控的促凋亡基因Fas及FasL蛋白的表达，从而发挥抗细胞凋亡和损伤保护效应。　　本研究发现，缺血预处理可通过降低肝脏缺血/再灌注早期核因子kB的转录活性，并下调促凋亡基因Fas及FasL的表达，而发挥抗细胞凋亡和损伤保护效应。核因子kB的活性改变可能是缺血预处理抗细胞凋亡中信号转导的关键步骤之一，干预NF-kB的活性将会对肝脏的缺血/再灌注损伤的治疗产生积极作用，为防治肝脏的缺血再灌注损伤提供了一个新的研究方向。【参考文献】　　[1] Vardanian AJ， Busuttil RW， Kupiec-Weglinski JW. 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