Smac和Ki67在肝外胆管异型增生组织和癌组织中的表达及意义

作者：康惠贞 李胜棉 赵玉斌 贾蔚娴    作者单位：(石家庄市第三医院消化内科，河北 石家庄 050011)

【摘要】  目的 探讨Smac和Ki67在肝外胆管癌发生发展中的作用和临床意义。方法 用免疫组化SP法检测27例肝外胆管癌组织、10例异型增生组织和5例正常肝外胆管上皮组织中Smac和Ki67的表达。结果 Smac在正常肝外胆管上皮组织、异型增生组织和癌组织中阳性表达率分别为40%、50%和85.2%，异型增生组织和癌组织中Smac表达差异有统计学意义(P=0.041)。Ki67在正常肝外胆管上皮组织、异型增生组织和癌组织中阳性表达率分别为0、40%和81.5%，正常肝外胆管上皮组织和癌组织中表达差异无统计学意义(P=0.001)，异型增生组织和癌组织中表达差异有统计学意义(P=0.038)。Smac和Ki67在异型增生组织和癌组织的表达呈正相关性(r=0.688,P=0.028)。Smac和Ki67的表达与肝外胆管癌组织病理学特征和临床分期无关。结论 Smac和Ki67参与了肝外胆管癌的发生发展,凋亡和增殖失衡在其过程中起重要作用，Smac和Ki67可能在异型增生向癌的恶性转化阶段起重要作用。

【关键词】  肝外胆管癌;异型增生;Smac;Ki67;免疫组织化学

肝外胆管癌是一种相对少见的疾病，其生长缓慢隐蔽，很难早期发现，往往以梗阻性黄疸为首发症状，手术切除率低，预后很差〔1〕。以往我们的研究表明在肝外胆管癌发生的癌序列中，凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达逐渐升高〔2〕; PCNA和Ki67在胆管癌中的表达较原位癌和非瘤组织中表达明显升高〔3〕;Smac是新近发现的凋亡相关基因蛋白，Ki67是一种较可靠的全面反映细胞增殖活性的指标〔4〕。本研究应用免疫组织化学SP法检测Smac和Ki67在肝外胆管癌序列中的表达，探讨凋亡和增殖相关基因与肝外胆管癌的发生发展和临床预后的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本 肝外胆管癌手术切除标本27例，包括24例高、中分化腺癌，3例低分化、未分化腺癌。临床分期根据1997年国际抗癌联盟(UICC)TNM分期标准分为Ⅰ+Ⅱ期共13例、Ⅲ+Ⅳ期共14例。10例肝外胆管异型增生组织，均取自癌组织边缘。5例正常肝外胆管上皮组织作为对照。所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，进行4 μm连续切片10张。标本HE染色后，组织学诊断至少有两名病理医师完成。异型增生组织学诊断依据以下标准〔5〕。

　　1.2 主要试剂 Smac兔抗人多克隆抗体购自Abcam公司。Ki67 鼠抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术公司。过氧化物酶标记的链霉卵白(SP)染色试剂盒，浓缩型二甲基联苯胺(DAB)试剂均为福州迈新生物技术公司产品。

　　1.3 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法。具体步骤按试剂盒说明书进行。Smac和Ki67一抗分别以1∶200和1∶80比例稀释。用已知的Smac蛋白阳性的心肌组织和Ki67蛋白阳性的肝癌组织作为对应的阳性对照。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。

　　1.4 免疫组化阳性染色指标的判定 Smac阳性染色判定参照童强松等〔6〕的评定标准。Ki67阳性染色判定参照万云乐等〔7〕的评定标准。每张切片观察从阳性染色最强的部位开始，400倍光镜下连续观察5个视野,根据Smac和Ki67阳性细胞所占的百分比分为4个等级：阳性细胞所占百分比<5%为阴性(-);阳性细胞所占百分比在6%～25%为弱阳性(+);阳性细胞所占百分比在26%～50%为中等阳性();阳性细胞所占百分比>50%为强阳性()。

　　1.5 统计学方法 利用SPSS10.0软件率的比较采用确切概率法和χ2检验。相关性检验采用Spearman等级相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 肝外胆管异型增生组织及癌组织中Smac和Ki67表达特征 Ki67在异型增生组织和癌组织中表达，阳性表达表现为胞核棕黄或棕褐着色。Smac在正常胆管上皮组织、异型增生组织和癌组织中均有阳性表达，为胞浆黄色或棕黄色片状或细颗粒状着色，见图1。

　　2.2 正常肝外胆管上皮组织、异型增生组织和癌组织中Smac和Ki67表达 Smac三种组织中表达差异显著(P<0.05)。异型增生组织和癌组织中表达差异显著(P<0.05)，正常肝外胆管上皮组织和异型组织中表达差异显著(P>0.05)，正常肝外胆管上皮组织和癌组织中表达差异不显著(P>0.05)。Ki67在三组中表达差异显著(P<0.05)。正常肝外胆管上皮组织和异型增生组织中表达差异不显著(P>0.05)，正常肝外胆管上皮组织和癌组织中表达差异显著(P<0.05),异型增生组织和癌组织中表达差异显著(P<0.05)，见图1。

　　图1 Smac与 Ki67在肝外胆管异型增生组织和癌组织中表达表1 三种组织和癌组织Smac 和 Ki67的表达1)与正常组织比较，2)与异型增生组织比较：P<0.05表2 肝外胆管癌组织中Smac和Ki67的表达与组织病理学特征和临床分期的比较

　　2.3 Smac和Ki67在肝外胆管异型增生组织和癌组织中表达的相关性分析 在10例异型增生组织中，4例Smac和Ki67同时阳性表达，5例同时阴性表达。27例肝外胆管癌组织中，20例两者同时阳性表达，6例阳性表达位于几乎相同的组织部位。10例肝外胆管异型增生组织中,Smac和Ki67的表达呈正相关(r=0.688,P<0.05)。27例肝外胆管癌组织中，Smac和Ki67的表达无相关性(r=0.371,P>0.05)。

　　2.4 肝外胆管癌组织中Smac和Ki67的表达与组织病理学特征和临床分期的比较 Smac和Ki67在肝外胆管高、中分化癌中的表达与低分化癌中的表达差异不显著，在有血管神经浸润，有淋巴结转移的肝外胆管癌组织中的表达与无血管神经浸润，无淋巴结转移的癌组织中的表达差异不显著，Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期的表达差异不显著(表2)。

　　3 讨 论

　　Suzuki等〔8〕证实肝外胆管癌的发生同结肠癌等其他的恶性肿瘤一样也存在异型增生到癌的序列发展过程。本实验27例肝外胆管癌伴发异型增生组织10例，占37.1%，支持肝外胆管癌发生经过癌前病变到癌的病理过程。

　　Smac/DIABLO被称为第二线粒体来源的胱氨酸酶激活剂(second mitochondriaderived activator of caspase，Smac)或低等电点的凋亡抑制蛋白家族(IAP)直接结合蛋白(DIABLO)，是2000年DU等〔9〕发现的一种存在于线粒体并且调节细胞凋亡的蛋白质，正常情况下存在GF 线粒体膜间隙,不具有促进细胞凋亡的功能,只有在凋亡因素的刺激作用下,从线粒体移位到细胞浆，在胞浆中成熟的Smac 通过其N末端的 Ala1Val2Pro3Ile4 (AVPI)序列，与过表达的Survivin、XIAP 等IAPs表面的BIR2/BIR3结合，解除IAPs对 caspase的抑制，从而促进细胞凋亡。

　　Smac在人类正常组织中普遍表达。尤其在成人睾丸组织中表达最高，心、肝、肾、脾、前列腺和卵巢中次之，脑、肺、胸腺和外周血淋巴细胞中表达低〔9〕。Smac在肿瘤组织中表达的研究数据不多，在颈部肿瘤中Smac的表达上调〔10〕，在肾癌组织中Smac的表达下调〔11〕。Yoo等〔12〕研究说明Smac表达水平变化由肿瘤的类型决定,可能与肿瘤的异质性有关。

　　本研究结果从一定程度上可以说Smac在肝外胆管癌组织上表达与正常肝外胆管上皮组织中的表达可能存在差异，异型增生组织和癌组织中Smac表达差异显著，说明Smac参与了肝外胆管癌的发生发展，在异型增生向癌的恶性转化阶段作用更明显。

　　Ki67是与细胞增殖相关的核抗原，分布于增殖细胞的核中，当增殖的细胞被诱导分化成熟进入静止期细胞，Ki67抗原消失。研究证实Ki67的表达与细胞周期密切相关，在G1后期开始出现，S、G2期升高，在M期达到高峰，在G0期不表达〔13〕。因为有丝分裂结束后Ki67的水平迅速降低，半衰期很短，故成为更可靠准确反映细胞增殖活性的指标〔14〕。

　　本研究结果说明异型增生组织与癌组织增殖活性明显升高，在肝外胆管癌发生发展中存在细胞的增殖失控。

　　本研究Smac与 Ki67在肝外胆管异型增生组织中表达呈明显的正相关，推测在肝外胆管异型增生阶段，Ki67促进细胞增殖，而Smac促进增殖细胞的凋亡，是机体维持增殖和凋亡平衡的一种保护性机制，在某种程度上可能延缓了肝外胆管癌的发生发展。或者本实验检测到的可能是Smac的突变体，突变体失去拮抗IAP抑制细胞凋亡的作用，失去促进细胞凋亡的作用，使细胞增殖失控，从而促进了肿瘤的发生发展。Smac与 Ki67在肝外胆管癌中的表达相关性分析说明它们之间可能存在正相关，但较异型增生组织中相关性降低，推测这与细胞发生恶性转化后，机体通过自身的反馈调节维持细胞增殖和凋亡严重失衡的能力降低有关。

　　本研究Smac与Ki67在肝外胆管癌中表达与肝外胆管癌的分化程度、有无血管神经浸润、有无淋巴结转移和临床TNM分期无关。Suto等〔15〕研究发现有淋巴结转移的肝外胆管癌中Ki67的表达明显升高，提示细胞增殖的加速对于肝外胆管癌的临床预后有重要影响。本研究结果与文献不一致，可能与本实验的样本量少有关，也可能与肿瘤的种类有关，但基因检测作为新的预测肿瘤发展和预后的方法，越来越被证实。所以不能简单地认为Smac和Ki67对肝外胆管癌生物学行为和临床预后的预测意义，需要更多的实验进一步研究。

　　综上所述，在肝外胆管癌发生的癌序列中存在凋亡和增值的失衡，尤其在异型增生向癌的恶性转化阶段。Smac是一种新的基因蛋白，它在肝外胆管癌系列中表达升高可能延缓或促进肝外胆管癌的发生和发展，有关它在肿瘤发生中的作用有待进一步探讨。

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