肝外胆管癌相关基因的研究进展

作者：徐力善　陈瑞    作者单位：中国人民解放军总医院　肝胆科　（北京　100853）

【摘要】  肝外胆管癌是一种恶性程度较高的肿瘤，早期诊断困难，预后较差。随着现代分子生物学的发展，人们不断发现与肝外胆管癌相关的癌基因、抑癌基因以及各种细胞因子和蛋白，并对其有了较为深入的了解，为肝外胆管癌的早期诊断和治疗提供了有利条件。

【关键词】  胆管肿瘤·胆管肝外·基因

肝外胆管癌是一种较少见的恶性肿瘤，一般认为其治疗难度较大，预后不佳。近年来肝外胆管癌发病率呈上升趋势，而发病的确切病因仍不明朗。已知的危险因素包括华支睾吸虫感染、原发硬化性胆管炎、胆结石、异常胰胆管畸形、胆总管囊肿、肝硬化和丙型肝炎病毒感染，可能的危险因素包括肝吸虫感染、HIV感染、乙型肝炎病毒感染、肝肠排泄障碍、环境或职业性中毒以及糖尿病［1］。

目前研究发现p53、p73、PTEN、K-ras、p16、c-myc、cerbB-2、Bcl-2和RASSF1等基因，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），4型黏蛋白（mucin 4，MUC4）、C-反应蛋白和鸟苷酸结合蛋白等与肝外胆管癌有关。

    1　p53基因

p53基因的变化是人类肿瘤研究中迄今为止发现的出现频率最高的分子学变化，几乎涉及人类恶性肿瘤总数的一半以上。而近期研究显示p53同胆管癌特别是伴有原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）的胆管癌的发病有关。

Ahrendt 等［２］评估患有PSC和胆管癌的患者其p53的表达以及K-ras基因突变所带来的影响和预期意义，发现12例肿瘤中的6例检测出突变p53的聚集。而p53突变阴性的肿瘤患者生存时间显著长于p53突变阳性的肿瘤患者（P＜0.05）；存在p53突变的过度表达的患者从诊断PSC到确诊胆管癌的间隔时间（2个月）较不存在p53突变的过度表达的患者（47个月）明显缩短（P＜0.05）。与单纯PSC患者比较，PSC伴发胆管癌的患者更易发生p53的过度表达以及K-ras基因突变；单纯PSC预后一般稍好，而p53和K-ras基因均表达者生存时间显著缩短。

Suto等［３］对52例肝外胆管癌患者的K-ras、p53和APC基因进行分析，结果显示K-ras、 p53和APC基因在肝外胆管癌患者中的突变率分别为9.6%、32.7%和0。

目前国内外也已有较充分研究证明p53 的表达与胆管癌的分化程度有关,可作为判断胆管癌预后的指标之一［4-６］。

    2　p73基因

p73基因与p53基因有显著的同源性，常出现于恶性肿瘤的发生发展过程中［7］，两者的作用有共同之处，因此也可以说两者属于同一家族。张智勇等［8］对41例肝外胆管癌及10例胆总管囊肿病例中p73和p53的表达进行研究，结果显示，肝外胆管癌病例中p73的表达率为41％，而胆总管囊肿病例中则未见表达，差异具有统计学差异（P＜0.05），提示p73基因在人类肝外胆管癌的发生、发展中有较为重要的作用；且p73和p53的表达具有相关性（P＜0.05），两者之间可能在体内有互补的作用。

    3　PTEN基因

另一个与p53有较密切关系的是PTEN，属近些年新发现的肿瘤抑制基因。Parsons等［９］认为，恶性肿瘤细胞的快速增长源于磷酸酶活性的下降，其直接原因之一就是肿瘤组织中PTEN的突变。国内学者采用免疫组化技术检测肝外胆管癌及正常胆管组织中PTEN蛋白的表达，结果显示正常胆管组织中PTEN 蛋白阳性表达率为90% （9／10），而肝外胆管癌组织中的阳性表达率仅为30% （12／40），两者差异有统计学意义（P＜0.05），且两者表达具有相关性（P＜0.05）［１０］。胆管癌组织中较低的PTEN阳性表达率提示，PTEN基因的失活可能在胆管癌的发生发展中起着重要作用，但其机制还有待进一步研究。

    4　K-ras基因

ras基因由K-ras、N-ras和H-ras构成，引起胆管癌的ras基因主要是K-ras和N-ras。K-ras基因点突变多见于胆管的癌变区或癌前病变，K-ras基因密码子第12位点突变，使其编码的甘氨酸变为天门冬氨酸，而胆管良性病变无K-ras点突变；K-ras基因点突变在肝门区的胆管癌较为常见［１１］。

    5　p16基因

p16基因又称MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，是1994年由美国率先报道的新型肿瘤抑制基因。定位于9号染色体q21，编码产物是一种相对分子质量为16×103的蛋白，可直接作用于细胞周期素依赖激酶4 （cyclin dependent kinase 4，CDK4）、CDK6及周期素D（cyclin D）等，抑制细胞从G1期向S期转变,起到改变细胞周期的作用，被认为是一个重要的肿瘤抑制基因。

p16基因缺失及突变在人类的恶性肿瘤中普遍存在。鲁建国等［１２］应用原位杂交方法在转录水平检测38例人胆管癌石蜡切片的p16表达，结果显示高分化腺癌p16表达阳性10例，阳性率为62.50%（10/16）；中分化腺癌阳性4例，阳性率为40.00%（4/10）；低分化腺癌阳性2例，阳性率16.67%（2/12），高分化组与低分化组比较p16阳性表达率差异有统计学意义（P<0.05），表明p16基因的失活与胆管癌分化不良有着较为密切的关系。李灼日等［１３］检测胆管癌、癌旁组织，胆管囊状扩张症组织及医源性胆道损伤的胆管组织中p16的蛋白表达，结果显示胆管癌组织中p16的阳性表达率明显高于其他组（P<0.05），高、中分化腺癌组织中p16阳性表达率明显高于低分化腺癌组织（P<0.05），Ⅰ级胆管癌组织的p16阳性表达率明显高于Ⅱ、Ⅲ级胆管癌（P<0.05），证实p16蛋白表达特征可反映胆管癌生物学行为和恶性程度。

    6　c-myc基因

c-myc基因位于8号染色体q24上,基因编码的的蛋白产物是p62,能使细胞无限增殖，导致细胞的恶性转化。有研究显示胆管癌p62表达阳性率可达94%，且染色强度和阳性率与细胞分化程度密切相关，高分化胆管癌阳性率高、染色强，低分化胆管癌p62阳性率低，染色较弱，提示c-myc的表达与胆管癌细胞分化程度、组织学分级等有关系［14］。

    7　cerbB-2基因

cerbB-2基因定位于17号染色体q21上,编码相对分子质量为185×103 、具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,又称p185。有研究表明，胆管癌组织中cerbB-2 蛋白与胆管组织癌变过程有关［１５］。但对于其表达与临床分期、病理类型、癌细胞分化及肿瘤部位等是否相关，目前还有争议。

    8　Bcl-2基因

Bcl-2（B cell lymphoma／leukemia-2）是从B细胞滤泡性淋巴瘤中分离出来的首个被认为有抑制凋亡作用的基因，位于18号染色体q21位点。其过度表达已被证实存在于多种肿瘤组织［１６］。近年的研究发现，Bcl-2启动子上存在NF-κB特异性结合点,其调控作用的一个关键组成部分是Kappa B激酶复合体［１７］。Viatour等［１８］对Bcl-2启动因子的分析同样显示Bcl-2启动子上有NF-κB的结合区域。此区域只能被p50或该区域与p52的二聚体激活，并且p50和此二聚体都可以通过与Bcl-3的结合来激活Bcl-2启动因子，由此证明了NF-κB的确可以激活Bcl-2。国内学者实验也表明，在肝外胆管癌组织中，NF-κB与 Bcl-2的表达有显著的相关性。转录因子NF-κB可对Bcl-2等抗凋亡基因具有正相调节作用，干预肝外胆管癌组织的抑制凋亡作用，影响肝外胆管癌组织的生长［１９］。

    9　RASSF1基因

RASSF1基因是于2000年Dammnn于3号染色体p21.3发现的一种新型抑癌基因［２０］。因其核苷酸序列C端与小鼠RAS效应蛋白Nore1的同源性很高，故得名RAS association domain family 1（RAS相关区域家族1）。已知RASSF1基因目前包含7种转录本（A～G），RASSF1A是其中最常见的一个，其cDNA全长1 873 bp, 编码含340个氨基酸的蛋白多肽。有研究表明RASSF1A基因的改变与肝细胞癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌的发病有关［２１］。Pfeifer等［２２］对RASSF1A功能分析显示，此蛋白很可能参与对凋亡信号的调控，从而对细胞周期产生影响。Wang等［２３］发现胆管癌组织中存在RASSF1基因的缺失，并认为其对恶性肿瘤的进展情况有影响。陈勇军等［２4］检测48例肝外胆管癌组织及12例癌旁正常组织中的RASSF1A表达情况，发现RASSF1A在肝外胆管癌组织中转录表达缺失阳性率可达68．75%，并且其缺失与肝外胆管癌的转移情况有关。RASSFI作为一种新型的抑癌基因可能为早期诊治肝外胆管癌提供一些新的道路。

    10　VEGF

VEGF是一种内皮生长因子，也是一种血管因子，是肿瘤血管生成中最重要的始动因子之一。VEGF可诱导肿瘤的血管形成和通透性增加，这对肿瘤组织特别是恶性组织的生长和转移有着重要的作用。抑制VEGF的传导通路成为近些年较受关注的抗肿瘤方法之一。有资料显示肝外胆管癌中VEGF的阳性率可达72.7％，并提出了nm23～H及VEGF作为两个独立因素分别与肝外胆管癌的局部浸润和转移有关［２５］。Benckert等［２６］调查了VEGF及转化生长因子（TGF）以及它们各自的受体在人胆管癌组织中的情况，证实胆管癌肿瘤细胞中VEGF过度表达，并在内皮细胞中发现了VEGF受体1和受体2，提示它们之间很可能有正向作用。国内学者研究认为垂体瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene，PTTG）和VEGF在胆管癌中存在着高表达，且两者呈正相关关系［２７］。

    11　MUC4

MUC4是覆盖在黏膜上皮表面的一种大分子糖蛋白，有抗黏附、抗免疫识别和促进肿瘤增殖等作用。在部分恶性程度较高的肿瘤中，正常的MUC4调节机制受到抑制，导致MUC4的高表达。Tamada等［２８］通过免疫组织化学方法对70例肝外胆管癌患者检测，结果36例检测出MUC4的表达。其中MUC4高水平表达的19名患者（约20%的癌细胞染色）的生存率显著低于MUC4低水平表达的51名患者（染色的癌细胞数<20%），P=0.002 7。单变量分析显示MUC4的高水平表达成为肝外胆管癌的重要危险因素之一（P＜0.01）。

    12　C-反应蛋白

近期有学者认为C-反应蛋白是肝门周围胆管癌患者的预后指标之一。Gerhardt 等［２９］分析98例肝门周围胆管癌患者的年龄、肿瘤分期、胆红素、凝血酶原时间、C-反应蛋白、糖抗原19-9、体重减轻病史、手术切除术、全身化疗和光动力疗法等多项因素与生存时间的关系，结果显示只有C-反应蛋白（P = 0.005）和手术切除（P=0.029）可以成为影响生存率的独立的预后指标。

    13　鸟苷酸结合蛋白

鸟苷酸结合蛋白,简称G蛋白，它可以控制信号传导通路的开启和关闭，并对传导信号可有放大作用，因此是生物信息传导过程中关键的中介体。有学者研究了G蛋白基因在肝外胆管癌肿的表达［30］，结果显示G-γ7在肝外胆管癌的表达显著低于胆管良性肿瘤（P=0.001）和正常胆管组织（P=0.002），差异有统计学意义,说明G-γ7有望成为一种能较准确的预测关外胆管癌病情进展的生物学标志物。

肝外胆管癌既往被认为是较少见而治疗困难的疾病。随着现代影像学的进步，肝外胆管癌的检出率逐渐增高。近代分子生物学的发展使肝外胆管癌的基因研究得到了很大发展，且业已有通过抑癌基因、自杀基因、免疫基因和抗肿瘤血管生成基因治疗等初步基因治疗方法。联合基因治疗可能成为未来的有效治疗方式。但从总体来说，对肝外胆管癌的基因研究还不甚完善，距临床应用还有较大的距离。相信随着近代分子生物学和分子遗传学的不断进步，对肝外胆管癌的基因研究将取得更大突破，为其早期诊治提供更大的帮助。

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