梗阻性黄疸选择性胆管外引流大鼠模型的建立

作者：曾永毅 张玉君 郑树国 董家鸿

作者单位：400038 重庆，第三军医大学西南医院全军肝胆外科研究所、中国人民解放军西南医院肝胆外科医院          【摘要】  目的 建立梗阻性黄疸选择性胆管外引流(约占30%肝脏体积)动物模型，了解其对胆汁分泌及肝功能改善的影响，为肝门部胆管癌减黄实验及临床研究提供参考。方法 采用结扎切断SD大鼠左中叶肝胆管及胆总管预制外引流管10 d的方法，制作大鼠选择性胆管外引流模型，在引流的0、1、4、7、10、14 d收集胆汁及检测肝功。结果 成功建立了大鼠完全梗阻性黄疸部分肝脏外引流的模型并观测到其对胆汁分泌及肝功能改善的影响。结论 与梗阻性黄疸全肝外引流模型相比，梗阻性黄疸约30%肝脏外引流能够改善肝功能，而且可以增加预保留肝的功能代偿。

     【关键词】  胆管肿瘤； 肝门部； 梗阻性黄疸； 大鼠

     Establishment of model of selective external biliary drainage in rats with obstructive jaundice  ZENG Yongyi, ZHANG Yujun, ZHENG Shuguo, DONG Jiahong. Southwest Hospital & Institute of Hepatobiliary Surgery, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China

    【Abstract】  Objective  To establish the model of selective external biliary drainage in rats with obstructive jaundice to understand its effects on bile secretion and hepatic function improvement so as to provide some reference for experimental and clinical researches on hilar cholangiocarcinoma.Methods  We employed double ligation of the common bile duct and the left and middle lobe bile duct and reset prefabricated external drainage duct in common bile duct for 10 days to make the model of selective external biliary drainage in obstructive jaundice rats. Bile was collected and hepatic function checked after drainage for 0, 1, 4, 7, 10, 14 days.Results  We successfully established the model of selective external biliary drainage in rats with obstructive jaundice and found improvement of bile secretion and hepatic function. Conclusion  Compared with total external biliary drainage in rats with obstruction jaundice, selective external biliary drainage can not only improve hepatic function, but also improve functional compensation of the remnant liver.

    【Key words】  Biliary tumor;  Hepatic portal;  Obstruction jaundice;   Rats

    肝门部胆管癌90%以上合并有不同程度的梗阻性黄疸，且大部分为完全梗阻性黄疸，术前多采取经皮经肝胆管引流(percutaneous transhepatic biliary drainage,PTBD)，以降低胆红素水平。肝门部胆管癌与其他引起梗黄的疾病有所不同，引流有以下特点：(1)Bismuth Ⅲ和Ⅳ型不易获得满意的胆道引流效果；(2)技术上困难，为达充分引流，需多支肝管引流；(3)引流的肝叶有可能是切除的肝叶；(4)导管并发症发生率高等［1-2］。Nimura等［3］建议选择性引流预保留肝脏可有效减退黄疸，增加预保留肝的功能代偿。故是否对预切除侧的胆管进行引流成为各家争论的焦点。鉴于目前肝门部胆管癌根治的外科治疗策略是扩大肝叶切除的特点［4］，同时借助于SD大鼠肝门部独特的解剖结构，我们建立了完全梗阻性黄疸选择性胆管外引流(预保留侧肝脏)的动物模型，模拟肝门部胆管癌预保留侧引流病理生理特点，以了解其对胆汁分泌及肝功能改善的影响，为进一步的实验及临床研究提供基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    6～8周龄SD大鼠由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，共150只，雌雄不限，二级动物， 体质量210～240 g， 平均体质量(226.94±12.33)g。大鼠饲养于恒温、清洁环境，喂标准饲料，维持12 h昼夜节律。遵守实验动物使用及管理原则。术前禁食12 h，不禁水。

    1.2  动物分组

    1.2.1  SO(Shame Operation)组，即假手术组：大鼠上腹部正中切口开腹后，暴露肝门，游离胆总管后关腹。术后10 d后于胆总管中上1/3切断，远端结扎，近端置入直径约0.9 mm硅胶引流管，经皮下隧道于颈部引出，收集胆汁。

    1.2.2  SED(Selective external biliary drainage)组，即梗阻性黄疸选择性胆管外引流组：于胆总管中上1/3切断，远端结扎，近端置入直径约0.9 mm硅胶引流管，经皮下隧道于颈部引出，引流管远端结扎。同时于肝脏左叶及中叶胆管汇合处双道结扎并切断肝管，离断左中叶周围潜在的胆管侧支，制成选择性胆管外引流模型(图1)。大鼠10 d后行胆道再通，即剪开硅胶管远端结扎处，同时给予饮用生理盐水以补充胆汁外引流引起的电解质丢失。

    图1  梗阻性黄疸选择性胆管外引流示意图

    1.2.3  TED(Total external biliary drainage)组，梗阻性黄疸全肝胆道外引流组：具体手术方法同SED组，但不结扎切断肝脏左叶及中叶胆管汇合处肝管(图2)。大鼠10 d后行胆道再通。

    图2  梗阻性黄疸全肝胆道外引流示意图

    3组分别于引流的0、1、4、7、10、14 d取材。每时相点6只，均设假手术组6只。各组动物若有死亡，均与同批SD鼠予以补充。胆汁采集时间4 h(9：00-13：00)，棕色瓶，开放当天的胆汁在开放引流后1 h收集，以排净积存在胆总管内的胆汁。

    1.3  观察指标

    (1)术后观察大鼠精神状态、活动情况、对外界刺激反应、进食水量、体质量、引流情况等。

    (2)取大鼠右肝脏组织用福尔马林固定液固定，常规方法脱水包埋，5 μm厚连续切片数张，HE染色，病理学检查。

    (3)下腔静脉抽血观测血清总胆红素(TBIL)，门冬氨酸氨基转移酶(AST)，γ谷氨酰基转移酶(GGT)，碱性磷酸酶(AKP)，白蛋白(ALB),总胆汁酸(TBA)，全自动生化分析仪检测。

(4)观测正常SD大鼠胆汁分泌及梗阻大鼠再通后胆汁分泌的量及胆汁总胆汁酸分泌量。

    1.4  统计学分析

    本实验数据采用SPSS 10.0软件进行分析。统计资料表达采用±s方式，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  大鼠一般情况

    大鼠梗阻10 d，巩膜及尾部皮肤明显黄染，活动仍较多，反映较机敏，体质量轻微下降。开腹见胆总管成囊性扩张，胆总管与左中叶胆管结扎处分界明显，开放引流管后胆总管囊性扩张消失，左中叶胆管仍成囊性扩张(图3)。绝大部分大鼠引流通畅，引流14 d，可见部分梗阻的左中叶轻度萎缩，余肝代偿性肥大。开放引流后，两实验组动物饮水增加，体质量逐渐下降， 黄染逐渐消退， 对照组动物体质量稍增加。

    图3  选择性胆管外引流模型(开放引流管后胆总管囊性扩张消失，左中叶胆管仍成囊性扩张)

    2.2  肝脏组织学观察

    可见与临床梗阻性黄疸相似的病理学改变。肝脏黄染并肿胀，肝脏淤血、水肿、肝细胞呈片状变性坏死，肝细胞排列紊乱，疏松变性，小叶间质炎症，炎细胞浸润，肝窦受压变窄，肝窦周围炎性细胞黏附，肝内胆管大量增生，其管壁周围炎症细胞浸润等。引流14 d，仍梗阻的左中右可见部分肝成早期肝硬化表现。引流10 d后，两实验组右肝组织形态基本恢复正常(图4)。

    图4  引流10 d实验组右肝组织形态基本恢复正常  (HE  ×40)

    2.3  肝功能指标

    从表1可以看出，两实验组TBIL、AST、GGT、AKP、 TBA在梗阻10 d后均明显升高，与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。总胆红素升高至对照组的100多倍；ALB下降，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。开放引流后，两实验组TBIL、AST、GGT、AKP、TBA均下降，尤其以TBA及TBIL下降显著，TED组较SED组下降速度快。引流10 d后，两实验组TBIL、 AST、 GGT、 AKP、 TBA均基本降至正常，与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。在引流过程中，血清白蛋白随引流时间的延长成逐渐下降趋势，整个引流过程中，SED组均低于TED组，但两组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

    2.4  胆汁及总胆汁酸分泌情况

    3组引流后14 d内每小时千克体质量胆汁分泌量SED组较SO及TED组低，SED组与SO组、TED组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。而TED组在引流的0、1 d胆汁分泌量明显高于SO组，与SO组相比差异有统计学意义(P<0.05)。随后胆汁分泌量也逐渐减少，至引流的第4天，与SO组相近，引流14 d后，胆汁分泌量也明显减少，与SO组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。开放引流的当天，TED组的每小时千克体质量总胆汁酸的分泌量高于对照组，随后逐渐减少，在引流的第1天，基本与对照组接近；引流第4天后就已经明显减少，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。SED组的每小时千克体质量的总胆汁酸的分泌量从开放表1  各组动物开放引流不同时间肝功能变化引流的当天开始就明显低于SO组及TED组，与两组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。随着引流时间的延长，SED组总胆汁酸的分泌也逐渐减少，但是，到了引流的第14天，每小时千克体质量总胆汁酸的分泌量却约占TED组的50%。随着引流时间的延长，胆汁中总胆汁酸的分泌量逐渐减少，这与胆汁的外引流引起胆汁酸大量丢失有关。

    3  讨论

    从以上的动物实验可以看出，我们成功的制作了梗阻性黄疸选择性胆管外引流的动物模型，并观察到梗阻性黄疸约30%的肝脏外引流一定时间后基本上能够达到与全肝外引流相似的肝功能改善及减黄效果，考虑这可能与保留侧肝脏功能的代偿有关。同时我们也观察到了在引流14 d后，选择性胆管外引流组出现梗阻的左中叶轻度萎缩，余肝肥大的征象，而在全肝外引流组动物则无肝代偿性肥大的征象。这种萎缩肥大综合征常由于较长时间的胆道梗阻［5］或选择性的门静脉栓塞［6］引起，虽然这种的肥大与门静脉栓塞引起的肝脏代偿性肥大相差甚远，但Miyagawa等［7］观察到与全肝引流相比，选择性胆管引流预保留侧肝脏明显增大，更有利于肝门部胆管癌行扩大切除术后保留侧肝功能的恢复。Saiki等［8］观察到内引流肝切除后肝再生明显优于外引流，并且动物体质量在引流后没有明显下降。我们观察到不管是完全外引流还是部分外引流，动物体质量均下降，白蛋白水平低，所以外引流时要注意补充外源性胆汁酸及白蛋白，以利于肝切除后的肝再生。

【参考文献】  ［1］ Jarnagin W R, Fong Y, DeMatteo R I, et al. Staging, resectability, and outcome in 225 patients with hilar cholangiocarcinoma. Ann Surg,2001,234(4):507-519.

［2］ Burke E C, Jamagin W R, Hochwald S N, et al. Hilar cholangiocarcinoma:patterns of spread, the importance of hepatic resection for curative operation, and a presurgical clinical staging system. Ann Surg,1998,228(3):385-394.

［3］ Nimura Y, Hayakawa N, Kamiya J, et al. Hepatic segmentectomy with caudate lobe resection for bile duct carcinoma of the hepatic hilus. World J Surg,1990,14:535-544.

［4］ 黄志强.肝门部胆管癌外科治疗面临的问题和出路.中华实验外科杂志,2004,21(7):773-775.

［5］ Neuhaus P, Jonas S, Bechstein W O, et al. Extended resections for hilar cholangiocarcinoma. Ann Surg,1999,230:808-819.

［6］ Imamura H, Shimada R, Kubota M, et al. Preoperative portal vein embolization: an audit of 84 patients. Hepatology,1999,29:1099-1105.

［7］ Miyagawa S, Makuuchi M, Kawasaki S. Outcome of extended right hepatectomy after biliary drainage in hilar bile duct cancer. Arch Surg,1995,130:759-763.

［8］ Saiki S, Chijiiwa K, Komura M, et al. Preoperative internal biliary drainage is superior to external biliary drainage in liver regeneration and function after hepatecctomy in obstruction jaundice rats. Ann Surg,1999,230(5),655-662.