供肝冷保存门脉再灌注制备大鼠肝移植模型

    作者：孙运鹏，廖毅，杨文军，周蒙滔，施红旗，张启瑜    作者单位：温州医学院第一附属医院 肝胆外科，浙江 温州 325000

    【摘要】  目的 在Kamada“二袖套法”基础上采用供肝冷保存时经门静脉再灌注的方法建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型，为以后进行肝移植免疫排斥、器官保存、缺血再灌注等进一步的实验研究提供安全、有效的模型制作方法。方法 将30只接受供肝移植的SD大鼠随机分为5组（n=6）：A为假手术组，开腹后不做任何处理即关腹；B组供肝修整后冷保存期不进行再灌注；C组供肝修整后以5 ml生理盐水经门静脉灌注；D组供肝修整后以10 ml生理盐水经门静脉灌注；E组供肝修整后以15 ml生理盐水经门静脉灌注。然后以改良Kamada“二袖套法”完成大鼠原位肝移植模型，观察各组受体大鼠一般情况、生存情况、肝功能情况和组织病理学改变。结果 B组大鼠术后苏醒时间明显长于A组和D组（P＜0.05)，其存活3 d体质量下降程度均高于各组，和D组相比差异明显（P＜0.05)，B组存活一周体质量增加程度明显小于A、D、E组（P＜0.05)；B组中位生存时间明显短于A组、C组、D组和E组（P＜0.05)，D组和E组中位生存时间无明显差异（P＞0.05）；术后第1、4、7天实验组大鼠ALT显著高于对照组（P＜0.05)，而D组大鼠ALT值明显低于B组和C组（P＜0.05)；实验组术后ALB均显著低于对照组（P＜0.05)，但D组下降程度较低，其ALB仍明显高于B、C、E组（P＜0.05)，且于术后4 d开始升高，E组术后ALB始终处于较低水平。结论 通过改进技术改善肝功能，提高了生存率，尤其在冷保存时经门静脉再灌注，在供肝的质量上明显优于不进行灌注组，并应严格掌握灌注液体量，10 ml灌注量明显优于其他液体量，能有效地驱除供肝内残留的血液和气泡。

    【关键词】  肝移植；大鼠；再灌注；动物模型

     Establishment of liver transplantation model in rats by portal vein reperfusion in cold preservation

    SUN Yunpeng， LIAO Yi， YANG WenJun， et al.  Department of Hepatobiliary， the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325000

    Abstract   Objective  To establish the model of orthotopic liver transplantation in rats by reperfusion via the portal vein during cold preservation on the basis of Kamada’s “two?鄄cuff” technique with some modification during operation. Thus， a safe and effective methods were provided for further study， such as immunologic rejection， organ preservation， ischemic and reperfusion injury. Methods  Thirty SD recipient rats were divided into 5 groups randomly. The group A only experienced a simulate operation. In the group B， the liver was just preserved after trimming. Five ml of physiological saline was reperfused into allograft through portal vein in the group C. Ten ml of physiological saline was perfused in group D， 15 ml of physiological saline in the E group. And then the general condition， the survival time， the liver function and histopathology examinations were observed. Results  The analepsia period in B group was significantly longer than that in group A and D (P＜0.05). In group B， the decreasing in weight when survived for 3 days was more than group D significantly (P＜0.05)， the middle survival time in A， C， D and E group was obviously longer than that in group B (P＜0.05). There was no difference between D and E group (P>0.05). The ALT　in experimental group was higher than that in the controlled group on 1， 4， 7 days postoperatively (P＜0.05). The ALB in experimental group was lower than that in the control group on 1， 4， 7 days postoperatively (P＜0.05)， but that in group D had little descend and still higher than that in the rest， was increased on 4 days postoperatively. However， the ALB in group E was always in low level. Conclusion  The liver function and survival rate largely improve due to the modified technique. The quality of the allograft， which undewent reperfusion during cold preservation gained an obvious advantage to the routine ones. At the same time， the quantity of the reperfusion liquid should be controlled； 10 ml reperfusion liquid can effectively lustrate the blood and the air that resided in the liver.

    Key words   liver transplantation； rats； reperfusion； animal model 建立稳定大鼠原位肝移植(rat orthotopic livertransplantation，ROLT)

    模型在研究器官保存、移植免疫耐受机制、移植排斥反应以及与手术有关的并发症的发病机制中具有重要意义。作者采用经腹主动脉灌注获取供肝，在供肝冷保存时经门静脉分别采用5 ml、10 ml、15 ml灌注液再次灌注的方法，从而获取质量更好的供肝，并选择出最佳灌注量。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料  肝移植供、受体均为SPF级封闭群雄性SD大鼠，体质量为250～280 g，购买并饲养于温州医学院实验动物中心。显微手术器械1套，7-0锦纶医用无损伤缝合针线，4％水合氯醛，乳酸林格氏液，自制门静脉、肝下下腔静脉的套管及胆管支撑管，所有手术操作均在温州医学院实验动物中心SPF级实验室内单人裸眼进行。

    1.2  实验分组  将30只接受供肝移植的SD大鼠随机分为5组（n=6）：A为假手术组，开腹后不做任何处理即关腹作为对照；B组供肝修整后冷保存期不进行再灌注；C组供肝修整后以5 ml生理盐水经门静脉灌注；D组供肝修整后以10 ml生理盐水经门静脉灌注；E组供肝修整后以15 ml生理盐水经门静脉灌注。

    1.3  实验步骤  供肝获取：大鼠常规禁食12 h，不禁水；4％水合氯醛腹腔注射麻醉，起效后将大鼠固定在自制的手术台上，腹部备皮、消毒，腹部正中切口直接剪开入腹。游离剪断肝周韧带，将肠道用湿纱布覆盖后移至左侧腹腔外，充分暴露术野，游离IVC直至右肾静脉水平，4-0丝线结扎、剪断肾上腺静脉，镰状韧带，用5-0带线缝合针缝扎、剪断左膈下静脉，完全游离出入肝的管道后穿刺阴茎背静脉，注入含25 IU肝素的生理盐水2 ml，完成供体全身肝素化，以棉签钝性分离腹主动脉，于髂总动脉与左肾动脉之间穿刺腹主动脉后以2.5 ml/min 的速度注入4℃ 乳酸林格氏液20 ml，并阻断胸主动脉，剪开下腔静脉作流出道，充分灌注肝脏，在灌注的同时不断用4℃乳酸林格氏液淋注肝脏表面降温；冷保存门脉再灌注：取下供肝修整后，C组以5 ml生理盐水经门静脉灌注；D组以10 ml生理盐水经门静脉灌注；E组以15 ml生理盐水经门静脉灌注；供肝植入：切除受体肝脏后，将供肝原位置于腹腔内，先行肝上下腔静脉重建，先后壁对后壁连续外翻缝合，至右侧角时与右侧缝线打结，再从右向左连续缝合前壁，找出受体门静脉完成门静脉袖套套接，放开门静脉血管夹及放开肝上下腔静脉Satinsky阻断钳，结束无肝期。同法套接肝下下腔静脉，经阴茎背静脉缓慢注入生理盐水、10％葡萄糖、5％碳酸氢钠按4∶3∶1的混合液2～3 ml，可见供肝色泽更鲜红，胆汁不断流出，肠系膜动脉搏动有力。将供肝胆总管支架管插入受体胆总管内，固定。术后处理以白炽灯复温，直至活动自如，单笼饲养，术后3 d内喂10％葡萄糖溶液，24 h后进食。

    1.4  观察项目  一般情况如术后苏醒时间、主动饮水时间、受体体质量变化；大鼠生存情况；测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白（ALB）、血清总胆红素（STB）的浓度；于术后第7天取肝组织10%甲醛固定，制成石蜡切片，常规HE染色，光镜下观察肝细胞及肝窦内皮细胞的形态学改变。

    1.5  统计学方法  数据用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.5统计软件进行处理，各实验组与对照组间采用t检验分析比较，各组术后与术前比较采用配对t检验，各组生存率比较采用?字2检验。检验水准：P＜0.05具有统计学意义。

    2  结果

    2.1  各组受体大鼠术后苏醒时间、主动饮水时间和受体体质量变化  B组受体苏醒时间、主动饮水时间最长，A组最短，其余各组介于A、B两组之间，B组时间明显长于A、D组（P＜0.05)。各组受体存活3 d时体质量下降幅度：A组无体质量下降，B组体质量下降明显多于D组（P＜0.05)，存活1周时体质量增加幅度B组显著小于A、D、E组（P＜0.05)，与C组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

    2.2  各组受体大鼠存活情况  A组大鼠全部存活，B组中位生存时间明显短于A组、C组、D组和E组（P＜0.05）；D组和E组中位生存时间差异无统计学意义（P＞0.05）。各组受体无手术死亡病例，3 d存活率分别为100％，66.7％，100％，83.7％和83.7％；1周存活率分别为100％，66.7％，66.7％，83.7％和83.7%，见表2。

    2.3  不同组受体大鼠ALT的变化  术后第1、4、7天各实验组大鼠ALT均显著高于对照组（P＜0.05），D组大鼠ALT值明显低于B组和C组（P＜0.05），但与E组无明显差异；B组与C组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

    2.4  不同组受体大鼠ALB的变化  术后第1、4、7天各实验组大鼠ALB均显著低于对照组（P＜0.05），但D组下降程度较低，其白蛋白仍明显高于B、C、E组（P＜0.05），于术后4天开始升高，E组术后各时间段白蛋白始终处于较低水平，见表4。

    2.5  病理切片结果  A组术后1周可见肝窦轻度扩张，余未见明显异常（见图1）；B组术后1周可见明显淤血改变（见图2）；C组术后1周可见肝细胞索断裂，也可见淤血改变（见图3）；D组术后1周可见汇管区淋巴细胞浸润（见图4）；E组术后1周可见肝细胞大片坏死，细胞桥消失，并可见小部分肝细胞出现脂肪空泡改变（见图5）。

    3  讨论

    大鼠肝移植在研究器官保存、移植免疫耐受机制、移植排斥反应等方面具有重要意义，自Lee等[1]于1973年最早提出模型制作方法以来，各种改良方法层出不穷，其中以Kamada等[2]人提出“二袖套法”最为实用，但是目前文献报道灌注的方法不尽相同，主要有经腹主动脉[3]、经门静脉[4]、经升主动脉[5]及同时灌注腹主动脉和门静脉[6]等。苏树炎等[7]研究认为经腹主动脉灌注是最简便、彻底的方法，灌注液主要经过腹腔干到肝固有动脉对肝脏进行灌注，也有部分的灌注液是通过肠系膜上动脉，流经肠系膜的毛细血管网，回流至肠系膜上静脉，再回流至门静脉，以对肝脏进行门静脉系统的灌注，达到双重灌注[6]的效果。但笔者认为，回流至门脉的量相对较小，不能对门脉充分灌注。

    经门静脉灌注操作步骤较多，对肝脏操作时间较长，易引起肝门部血管痉挛，影响血供，增加热缺血时间，且穿刺灌注压力不好控制，门静脉易损伤，给后续袖套制备带来麻烦。从葛勇胜等[8]的研究资料可以看出，经腹主动脉灌注组的ALT、AST、STB在术后第4天两组之间无差别，在术后第7天均较经门静脉灌注组的值低，到第7天时已基本正常，而经门静脉灌注组的ALT、AST、STB直到第10天才正常。这说明经门静脉灌注肝功能恢复的速度较经腹主动脉灌注的方法慢。

    因此作者尝试在经腹主动脉灌注获取供肝后，于修肝后经门静脉袖套再次灌注，并选择不同体积的灌注液以筛选最佳灌注量。通过对大鼠一般情况、生存时间、肝功能及病理切片的观察发现，再次灌注组明显优于未行灌注组，而再次灌注组大鼠术后情况随着灌注液体的量有所不同。这说明再次灌注可以保证供肝灌洗相对均匀、彻底，对肝功能影响较小，避免直接经门静脉产生过大压力导致肝内结构受损，从而明显促进术后肝功能的恢复；同时在操作过程中，通过门静脉袖套进行再次灌注时还可以检查门静脉的完整性以及整个肝内血流通畅情况。

    通过实验作者发现250～280 g大鼠体内血液约12～13 ml，肝脏的血供主要由门静脉提供，门脉血流占全身血流约80％，故流经门脉的血流约为10 ml，因此本实验设计以10 ml为中心向两侧取值，分别用5 ml、10 ml、15 ml 4℃乳酸钠林格液分3组经门静脉灌注。作者发现，10 ml组在术后生存时间、肝功能的恢复及病理改变等方面明显优于5 ml和15 ml组，考虑5 ml组可能因为灌注量不足，未能完全分布于整个肝脏管道系统，不能完全清除肝内淤血、气泡和代谢产物及高浓度肝素；对于15 ml组考虑可能和供肝冷缺血时间过长及缺血再灌注损伤有关。因此本实验选用10 ml既可以达到有效灌注又不至于造成时间、资源上的浪费，保证了供肝的质量，具体机制尚需进一步进行实验与探讨。

【参考文献】[1] Lee S， Charters AC， Chandler JG， et al. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat[J]. Transplantation，1973，16(6)：664-669.

[2] Kamada N， Calne RY. A surgical experience with five hurdred thirty liver transplantation in the rat[J]. Surgery，1983，93(1 Pt 1)：64-69.

[3] 吴星宇，李江利，仇毓东，等. 大鼠原位肝移植的手术技巧[J]. 肝胆外科杂志，2004，12(5)：376-377.

[4] 彭勇，龚建平，刘长安，等. 大鼠原位肝移植手术技巧及常见并发症的防治[J]. 肝胆外科杂志，2004，12(3)：211-213.

[5] 何建宏. 经升主动脉灌注的无心跳供体大鼠原位肝移植模型的建立[J]. 中国普通外科杂志，2005，14(7)：489-490.

[6] 马毅，何晓顺，陈规划，等. 大鼠原位肝移植模型的手术技巧及并发症的预防[J]. 中华显微外科杂志，2003，26(1)：45-47.

[7] 苏树炎，霍枫. 大鼠自体肝移植中三种不同肝脏灌注方法的比较[J]. 肝胆胰外科杂志，2008，20(4)：248-253.

[8] 葛勇胜，许戈良，李建生，等. 供肝的不同灌注方法在大鼠肝移植中的应用[J]. 实用医学杂志，2006，22(22)：2485-2487.