α-硫辛酸对大鼠肝缺血再灌注后缺血型胆道病变防治作用的实验研究

　作者：黎一鸣　李华　姜维明    作者单位：西安交通大学医学院第二附属医院　普通外科　（陕西　西安　710004）

　【摘要】  目的：探讨大鼠肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）后缺血型胆道病变的发生机制及α-硫辛酸（alpha-lipoic acid, α-LA）对其的防治作用。方法：成年健康雄性SD大鼠90只，随机分为正常对照组（N组）、I/R组、α-LA处理组（LA组），建立全肝缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）模型。检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transferase，GGT）、总胆红素（total bilirubin, TBIL）水平；电子显微镜观察胆小管变化；FITC-Phalloidin显示胆小管F-actin微丝的分布变化，激光共聚焦显微镜采集图像并定量分析。结果：I/R组血清ALT、AST、GGT和TBIL水平与N组相比明显升高（P<0.05），LA组血清ALT、AST、GGT和TBIL水平与I/R组相比明显降低（P<0.05）。F-actin荧光变化和电子显微镜超微结构改变相符，I/R各组F-actin荧光染色紊乱、减弱，强度明显低于N组（P<0.05）；胆小管微绒毛大量脱落，管腔扩张。LA组病理改变较轻，F-actin荧光染色减弱，但程度较I/R组轻，荧光紊乱不甚明显，平均荧光强度高于I/R组（P<0.05）；胆小管微绒毛部分脱落，管腔扩张亦不明显。结论：肝脏I/R可造成胆小管F-actin微丝破坏、微绒毛丧失，导致胆小管收缩减弱，胆汁排泄功能受损，这可能是大鼠肝脏I/ R后缺血型胆道病变发生的主要机制；α-硫辛酸通过清除氧自由基，降低脂质过氧化反应，调节细胞内氧化剂-抗氧化剂的含量，保护胆小管F-actin微丝结构免遭缺血再灌注损伤破坏，进而预防和治疗缺血型胆道病变。

　【关键词】  α-硫辛酸·再灌注损伤·缺血型胆道病变·肌动蛋白类

 　 Experimental study on preventive and therapeutic effect of alpha-lipoic acid on ischemic type biliary lesion after ischemia–reperfusion in rat liver

    LI Yi-ming, LI Hua, JIANG Wei-ming

    Department of General Surgery, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiaotong University （Xi’an 710004, China）

    【ABSTRACT】 Objective: To investigate the mechanism of ischemic type biliary lesion after ischemia-reperfusion（I/R）in rat liver and the role of α-lipoic acid in the prevention and treatment. Methods: Ninety Sprague Dawley rats were divided randomly into three groups: normal control （N）, ischemia reperfusion （I/R） and alpha-lipoic acid pretreatment （LA） groups. The model of rat hepatic ischemia-reperfusion was established. The activity of serum ALT、AST、γ-GGT and TBIL were measured. The changes of bile canaliculus were observed by transmission electron microscope. The modification of F-actin microfilaments was quantified using FITC-Phalloidin and analysised by confocal laser scanning microscopy （CLSM）. Results: The ALT、AST、γ-GGT and TBIL levels of the ischemia reperfusion group was significantly increased （P<0.05）, while the alpha-lipoic acid pretreatment group was significantly decreased （P<0.05） compared with the normal control group. Bile canalicular F-actin was destroyed after reperfusion and this modification of F-actin staining was consistent with the observation by transmission electron microscopy. The staining of F-actin in the ischemia reperfusion group was decreased significantly （P<0.05） compared with the normal control group. There was a marked loss of canalicular microvilli and distension of canalicular lumen in the ischemia reperfusion group. The staining of F-actin in the LA group was significantly increased than those in the I/R group （P<0.05）. Conclusions: Ischemia reperfusion induces an disruption of bile canalicular F-actin microfilaments and a loss of microvilli. Alpha-lipoic acid can protect bile canalicular F-actin microfilaments against IRI.

    【KEY WORDS】 Alpha-lipoic acid·Reperfusion injury·Ischemic type biliary lesion·Actins

    　　肝脏缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）是导致缺血型胆道病变最重要的原因之一［1］，其机制尚未完全了解。F-actin微丝沿质膜分布，尤其在胆小管区域，对胆小管收缩引起胆汁排泄起重要作用［2］。α-硫辛酸（alpha-lipoic acid, α-LA）是已知天然抗氧化剂中效果最强的一种，已有国外文献报道，α-硫辛酸在肝IRI中，对肝细胞具有保护作用［3］，但α-LA对肝IRI后缺血型胆道病变的防治作用，国内外文献尚未见报道。本研究在大鼠全肝缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）模型的基础上，以胆小管F-actin微丝为研究靶点，以α-LA为干预措施，结合血清淤胆指标，研究肝I/R后胆小管F-actin微丝的变化以及α-LA在肝IRI中对胆小管F-actin微丝是否具有保护作用，以期探讨α-LA在预防肝I/R后缺血型胆道病变发生的保护机制，为防治肝I/R后缺血型胆道病变提供理论依据及新的途径，为α-LA应用于临床提供事实及理论依据。

    1　材料与方法

    1.1　实验动物及分组　雄性SD大鼠90只，6~8周龄，体质量200~250 g，西安交通大学医学院实验动物中心提供。90只大鼠随机分成对照组（N组）、I/R组及α-LA处理组（LA组）3组，每组30只，并按I/R不同时相分为I/R 2、6和24 h 3个亚组，每个亚组各10只。

    1.2　主要仪器与设备　异硫氢胍荧光素标记的鬼笔环肽（FITC－Phalloidin）和抗荧光衰减封片剂均购自Alexis公司。透射式电子显微镜（日立HITACHI公司H-600），由西安交通大学医学院电子显微镜中心提供。激光共聚焦显微镜（型号：TCS Sp2）由西安交通大学医学院中心实验室提供。

    1.3　方法　

    1.3.1　动物模型制作及取材　大鼠术前12 h禁食、自由饮水。3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30 mg/kg），取上腹正中切口入腹，游离肝蒂，用无创血管夹夹闭，造成100％实质性肝缺血，持续35 min后去除血管夹，形成再灌注。N组仅开腹解剖肝门，不做肝血流阻断及再灌注。LA组于缺血前15 min腹腔注射α-LA，剂量100 mg/kg，α-LA于注射前溶于载体（成分：乙醇35%，聚乙二醇400 35%，0.9%生理盐水30%）。N组和I/R组于相应时相点注入等量空白载体。至预定时相点取材，心脏采血，制备血清。迅速切取肝脏组织，部分低温下细切为1 mm3大小，2.5％戊二醛固定，备电子显微镜标本；部分用冰生理盐水洗去血迹、拭干，快速置入冻存管，于液氮罐冷冻后移入-80 ℃冰箱保存，待F-actin检测；部分置10％甲醛保存。

    1.3.2　检测项目　测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ－谷氨酰转肽酶（γ-glutamyl transferase，GGT）和总胆红素（total bilirubin， TBIL）。肝组织石蜡标本HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理改变；透射电子显微镜观察胆小管超微结构改变。F-actin检测［4］：1）将- 80 ℃冰箱保存的肝脏组织于低温切片机（- 28 ℃）下切成8 μm厚的冷冻切片。2）PBS简单冲洗、晾干，用3.7％的多聚甲醛于室温下固定10 min，PBS洗3次。3）滴加FITC－Phalloidin染色液（甲醇溶解，PBS稀释至10 μg/mL），室温孵化1 h，PBS冲洗3次，每次15 min，洗去多余荧光；以上步骤避光操作。4）抗荧光衰减封片剂封片。5）于激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，测定胆小管膜平均特异荧光强度。

    1.4　统计学处理　采用SPSS13.0统计软件包进行分析，实验数据用x±s表示，各组间比较用方差分析、Dunnett－t检验，组间方差不齐时采用非参数秩和检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　血清ALT、AST、GGT和TBIL水平的变化　血清ALT、AST水平，I/R各组明显升高，再灌注6 h时达最高，随后下降，与相应时相点N组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；LA组和I/R组比较明显下降，二者差异有统计学意义（P<0.05），但仍高于N组（P<0.05，表1）

    血清GGT、TBIL水平，I/R各组明显升高，均呈持续升高趋势，和相应时相点N组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。LA各组与相应时相点I/R组比较均明显下降（P<0.05），但仍高于N组（P<0.05，见表1）

    2．2　光学显微镜下肝组织病理改变　N组肝组织形态无明显变化，为正常肝组织形态学表现。肝小叶组织结构完整，肝细胞板以中央静脉为中心向四周呈放射状排列。肝细胞胞质嗜酸红染，细胞核大、形圆，位于细胞中央，核膜清晰完整，核仁明显。I/R组肝组织轻度炎性反应，再灌注后6 h最严重，肝小叶结构基本正常，小叶间动、静脉结构正常，出现中央静脉与肝窦充血，部分肝窦内皮细胞脱落，肝索无崩解。肝细胞明显水肿，胞质疏松、气球样变，可见少许肝细胞坏死，肝小叶内有中等量中性粒细胞浸润。LA组偶见散点状坏死，也见肝细胞肿胀、空泡变性，但细胞完整清晰，其程度、范围均较I/R组轻。

    2．3　透射电子显微镜下各组胆小管的改变　电子显微镜下可见N组正常大鼠胆小管横切面的形态外观，管腔面微绒毛丰富，肌动蛋白微丝形成的微绒毛核心清晰可见，胆小管周围的肝细胞膜形成紧密连接、桥粒等连接复合体封闭胆小管（图1 A）。I/R组多数肝细胞肿胀，细胞核形状不规则，核内染色质呈团块状凝集、边集，细胞质内线粒体明显肿胀，体积增大，数量增多，线粒体嵴溶解、消失呈均质状，粗面内质网略有扩张，数量减少，偶见凋亡的肝细胞及凋亡小体，胆小管形态明显改变，管腔扩张，腔面微绒毛脱落、减少，腔内可见胆汁淤积，其连接结构不清晰（图1 B）。LA组肝细胞基本正常，结构不如N组清晰，细胞核基本呈圆形，核内染色质轻度凝集，细胞质内细胞器丰富，线粒体轻度肿胀，粗面内质网呈层状分布，附着的核糖体可见，细胞质内还可见到少量脂滴，胆小管细长，管腔扩张不明显，腔面微绒毛丰富，腔内未见胆汁淤积，其紧密连接结构基本清晰（图1 C）。

    2．4　F-actin的分布变化　N组可见F-actin的荧光染色沿肝细胞基底膜和胆小管膜分布，F-actin在胆小管横切面呈明亮的小点状荧光，N组各亚组无明显差异（图2 A）。I/R组中2、6及24 h亚组，F-actin的荧光染色均明显减弱，可见肝细胞基底膜的荧光紊乱，胆小管膜的荧光强度也大大减弱，代表胆小管F-actin的小点状荧光减少、甚至消失（图2 B）。LA组中2h、6h及24h亚组，F-actin荧光染色减弱，但程度较I/R组轻；肝细胞基底膜的荧光紊乱不甚明显，代表胆小管F-actin的小点状荧光仍然可见（图2 C）。

    2．5　胆小管膜F-actin的定量分析　各组胆小管膜F-actin的平均荧光强度见表2，I/R组中2、6和24  h亚组胆小管膜F-actin的平均荧光强度明显减弱，和相应时相点N组比较均有显著性差异（P<0.05）。 LA各组和相应时相点I/R亚组比较，平均荧光强度高于I/R组，二者差异有统计学意义（P<0.05），但仍低于N组（P<0.05）。

    3　讨论

    由于外科技术的不断提高，非外科技术原因的移植肝缺血型胆道病变（ischemic type biliary lesion,ITBL)成为肝移植术后胆道并发症的主要类型，发生率为2%~19%［5］。ITBL主要表现为肝移植术后移植肝非吻合性的移植肝胆管树的破坏，胆道的狭窄、胆泥形成，甚至胆道毁损和移植物丢失。IRI是导致ITBL最重要的原因之一［1］。因此从临床角度出发，研究肝脏I/R后ITBL发生的机制及α-LA的保护作用具有重要的理论意义。

    胆汁在肝内的排泄依赖于胆小管的收缩，胆小管是胆汁排泄的最小管道，对胆汁的排泄起重要作用［6］。位于汇管区周围的胆小管连续、有力、单向的收缩运动，可有效地将胆汁推向肝门部的胆管［7］。胆小管结构的存在和功能的维持依赖于肝细胞骨架的完整。细胞骨架的主要成分为微丝，微丝的基础蛋白是肌动蛋白（actin），actin在细胞内以聚合态F-actin和游离态G-actin2种形式存在［7］。正常情况下细胞内的2种actin处于聚合/解聚的动态平衡中，2者之间的转化受多种因素影响。当受到一定的刺激后，细胞内游离的G-actin彼此结合形成F-actin，进而通过自身螺旋组装形成微丝，此过程即细胞骨架重排［8］。F-actin能改变其空间结构，完成特定功能，所以能较好地反映细胞骨架的变化。F-actin沿质膜分布，尤其在胆小管区域，在胆小管收缩引起的胆汁排泄中起重要的作用。胆小管微绒毛包含有许多F-actin微丝束，这些微丝从质膜延伸至管腔共同构成胆小管微绒毛的内芯。研究表明，F-actin微丝连续地聚合与解聚作用实现胆小管的收缩，进而促进胆汁排泄［2］。改变F-actin微丝结构，将破坏胆小管收缩，从而导致胆汁淤积［9］。

    本研究显示，血清ALT、AST水平，于再灌注6 h组达最高，随后下降；与此相反，血清GGT和TBIL水平各组间呈持续升高趋势。这说明肝脏经历轻度热IRI后，肝细胞发生可逆性损伤，并出现胆汁淤积；随着受损肝细胞的逐渐恢复，胆汁淤积仍然存在。荧光变化和超微结构改变相符，再灌注2～24 h，F-actin荧光染色紊乱、减弱，强度明显低于对照组，胆小管微绒毛大量脱落，其结果与再灌注后血清GGT和TBIL的异常改变相一致。这充分说明鼠肝I/R后F-actin微丝破坏、细胞骨架崩解导致胆小管收缩功能受损，胆汁排泄障碍，从而导致ITBL。文献报道，F-actin微丝于再灌注之后的这种损伤性改变可能是活性氧（ROS）、细胞钙超载和ATP耗竭共同作用对其破坏的结果[10]。

   α-LA是具有水溶与脂溶双重特性的一种抗氧化剂，可以进入细胞的脂相和水相部分，可以在任何部位清除自由基，发挥“全能抗氧化剂”的作用，是整个抗氧化防御网络中最多能、最强有力的抗氧化剂。α-LA对I/R组织的保护作用可能主要是因为其抗氧化作用。Sundaram等[11]在用α-LA对老年大鼠进行研究时发现，LA可通过抗氧化作用减少氧化剂的生成、脂质过氧化、蛋白羟基化和DNA链的断裂。同样，LA能通过增强对氧自由基的清除，对肝IRI起着良好的抗脂质过氧化作用[3]。

    本研究中，肝脏I/R后，血清氨基转移酶和淤胆指标升高，胆小管管腔扩张，腔面微绒毛减少、脱落，腔内淤胆，紧密连接结构不清晰，荧光染色可见肝细胞基底膜的荧光紊乱，代表胆小管F-actin的小点状荧光减少、甚至消失。α-LA预处理可明显改善这种损伤。在LA组，相应的血清学指标ALT、AST、GGT、TBIL明显降低；电子显微镜下可见胆小管细长，管腔扩张不明显，腔面微绒毛丰富，腔内未见胆汁淤积，紧密连接结构基本清晰；荧光染色肝细胞基底膜的荧光紊乱不甚明显，代表胆小管F-actin的小点状荧光仍然可见，平均荧光强度高于I/R组。α-LA对F-actin微丝保护的机制可能与下列因素有关：1）清除氧自由基，抗脂质过氧化作用。氧自由基可以直接或间接破坏F-actin微丝，α-LA能通过增强氧自由基的清除，再生细胞内其他抗氧化剂，减轻氧自由基介导的F-actin微丝结构和功能的损害, 从而实现其在肝脏I/R中对F-actin的保护作用。2）减少肝细胞ATP分解，增加ATP生成，延缓ATP耗竭。ATP的耗竭使F-actin断裂从而引起细胞骨架的破坏。α-LA可增加肝细胞ATP生成，以加强肝细胞能量储备，对肝细胞高能磷酸化合物具有明显保护作用。3）减轻钙超载。肝脏IRI使细胞内外钙的动态平衡紊乱，细胞发生钙超载，细胞内Ca2+浓度增高可激活Ca2+依赖性蛋白酶破坏actin细胞骨架。α-LA通过强大的氧自由基清除作用，减轻线粒体及肌浆网膜损伤，增加ATP含量，提高Na+/K+-ATP酶活性和肌浆网对Ca2+的摄取能力，减轻钙超载而间接的保护F-actin，免受IRI。

   综上所述，肝IRI是肝移植术后发生ITBL的重要原因之一。IRI可造成胆小管F-actin微丝破坏、微绒毛消失，导致胆小管收缩减弱，胆汁排泄功能受损，这可能是大鼠肝I/R后缺血型胆道病变发生的主要机制。α-LA能够通过减少氧自由基的生成，降低脂质过氧化反应，调节细胞内氧化剂-抗氧化剂的含量，减少炎症介质的释放，提高ATP含量等作用，有效地减轻肝I/R对胆小管的损伤。由于肝IRI机制复杂，造成I/R后ITBL的因素众多，故对于α-LA抗肝IRI的作用、α-LA对胆小管F-actin保护作用及肝I/R引起的ITBL防治作用的主要分子机制应进一步研究和探讨。

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