肝纤维化基因治疗研究进展

　作者：赵刚 综述，吴志勇 审校    作者单位：上海交通大学医学院附属仁济医院 普外科，上海 200127

　【摘要】  肝纤维化是肝脏受到损害因子长期刺激的结果，并将最终演变为肝硬化。肝纤维化是一个可逆的过程。现代基因治疗技术的进步为肝纤维化和肝硬化的治疗带来了新的希望。本文着重就肝纤维化的分子机制研究和载体技术在肝纤维化基因治疗中的应用作一综述。

　【关键词】  肝纤维化；分子机制；载体技术；基因治疗；综述文献

 　1  针对肝纤维化分子机制进行的基因治疗研究

    1.1  肝星状细胞的调控  肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖是肝纤维化发生发展的中心环节和共同通路[3]。活化HSC表达α?鄄平滑肌肌动蛋白 （smooth muscle?鄄alpha，α?鄄SMA）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。活化的HSC可分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原、层黏蛋白等多种纤维化过程中的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）成分，活化的HSC还可以分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制物基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP），引起ECM降解相对不足，过多沉积在肝内，导致肝纤维化形成。因此HSC的活化与增殖调控是肝纤维化基因治疗的重要途径。

    1.1.1  抑制HSC的活化  由于肝脏的氧化应激和炎症反应是肝纤维化发生的始动环节，诸多炎症因子都可活化HSC，导致肝纤维化的发生发展[4]。研究发现，水飞蓟素（Silybum）、从豆类中提炼出的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine）、S腺苷蛋氨酸（S?鄄adenosyl?鄄L?鄄methionine）等[5]抗氧化剂可通过抑制HSC的活化而减轻肝纤维化的程度。IFN?鄄α能够抑制HSC的活化，并能直接抑制ECM的合成。Chen等[6]实验证实IFN?鄄α能够有效抑制HSC的活化，同时使HSC细胞中α?鄄SMA的表达量和TIMP?鄄1、转化生长因子（TGF?鄄β）的mRNA水平降低。

    其他一些细胞因子如曲古抑菌素A[7]、甘草酸[8]、棕榈酸视黄醇[9]和白藜芦醇[10]等，也被证实能抑制HSC的活化。

    TGF?鄄β是HSC活化最有效的刺激因子[11]。肝损伤时，ECM释放TGF?鄄β，TGF?鄄β能够促进HSC活化，但抑制HSC的增殖，同时抑制肝细胞增殖，诱导肝细胞凋亡；TGF?鄄β通过Smad信号通路促进胶原合成，抑制MMP合成，促进TIMP的合成；而MMP合成的减少将导致ECM降解不足，致使ECM积累。一些抗TGF?鄄β受体在动物实验模型中都获得了较好的效果，丝氨酸蛋白酶抑制剂可以阻止TGF?鄄β活化[12]；Smad?鄄7转移因子可以阻断TGF?鄄β在细胞内的信号通路[13]；我们的研究也证实，通过RNA干扰TGF?鄄β传导通路上的Smad?鄄2的表达，抑制TGF?鄄β对HSC的活化[14]。

    过氧化物酶体增殖物激活受体?鄄γ（peroxisome proliferator activator receptor gamma，PPAR?鄄γ)能够控制细胞的生长和分化，噻唑烷二酮类作为PPAR?鄄γ配体可以抑制HSC的活化和促进纤维溶解[15]。卡托普利（血管紧张素转换酶抑制剂）和坎地沙坦（血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂）[16]同样可通过作用于HSC，促进纤维溶解而减轻肝纤维化的程度。

    1.1.2  抑制HSC的增殖  血小板衍生生长因子（platelet?鄄derived growth factor，PDGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、成纤维细胞生长因子、Ⅰ型胰岛素样生长因子（insulin?鄄like growth factor，IGF?鄄Ⅰ）等在急、慢性肝脏损伤情况下可通过酪氨酸激酶受体信号途径促进HSC增殖[17]。其中PDGF尤为重要，磷酸二酯酶抑制剂3?鄄7?鄄二甲基黄嘌呤可阻断PDGF相关的HSC有丝分裂[18]。三硝基苯基（TNP?鄄470）的抗血管生成特性也可抑制HSC增殖[19]。而小分子酪氨酸激酶受体抑制剂有望通过进一步修饰而应用于肝纤维化治疗[20]。

    1.1.3  诱导HSC凋亡  肝纤维化自发性逆转主要依赖HSC的凋亡[21]，HSC凋亡后数量减少，ECM分泌减少，TIMPs合成下降，MMPs活性增加，ECM降解增加，从而促进肝纤维化逆转。HSC凋亡调控机制复杂，死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径是介导HSC凋亡最为重要的途径。

    HSC表达许多细胞表面死亡受体，如Fas配体[22]、TNF?鄄α、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）[23]等均可作用于相应受体而在体外诱导HSC凋亡；地西泮[24]通过作用于线粒体孔道外周型苯二氮卓受体（PBR）而促进HSC凋亡；支霉菌素[25]和柳氮磺胺吡啶[26]通过抑制核转录因子（NF?鄄κB）而促进HSC凋亡。

    1.2  促进细胞外基质的降解  ECM的合成与降解失衡、基质的重构和间质型胶原成分Ⅰ/Ⅲ型胶原等异常增多沉积是肝纤维化的病理基础。因此，增加胶原酶的基因表达，调节内源性胶原酶的生物活性，降解增多的ECM是逆转肝纤维化进程的关键[27]。

    MMPs是一组能降解ECM的蛋白分解酶，在ECM降解过程中起关键作用，MMPs的活性与其特异性抑制因子TIMPs在组织中的表达密切相关。目前，MMPs和TIMPs已成为肝纤维化基因治疗的重要靶点[28]。MMPs家族按底物不同主要有间质胶原酶、明胶酶、间质溶解素和膜型MMPs（MT?鄄MMPs）4类。目前已发现的 TIMPs 包括 TIMP?鄄1，?鄄2，?鄄3，?鄄4四种，都可与特定的活性MMP结合成1∶1复合物，抑制后者对 ECM的降解活性。

    研究发现，将MMPs的表达质粒[29]或TIMPs的反义寡核苷酸质粒[30]转染肝纤维化大鼠，可促进Ⅰ/Ⅲ型胶原的降解，逆转纤维化；生殖激素松弛酞（relaxin）[31]也可通过下调TIMPs而减少HSC激活所致的胶原沉积；脯氨酸?鄄4?鄄羟化酶抑制剂[32]可通过抑制TIMPs的作用，相对提高MMPs的活性，从而促进ECM降解，逆转肝纤维化。

    尿激酶型纤溶酶原的激活物(urokinase plasminogen activator，UPA)是ECM裂解蛋白级联的始动因子，同时UPA也可使肝细胞生长因子（HGF）的表达增加，上调MMP的活性，促进肝纤维化的逆转和肝细胞再生[33]。

    2  载体技术在肝纤维化基因治疗中的应用

    　　  有效的基因转移是基因治疗的关键，细胞因子如何能在靶细胞中发挥最大的效力，选择合适的载体显得极为重要。理想的载体应具备特异性高、亲和力强、载基因容量大、整合转染效率高、抗原性及毒性小和表达功能基因持续时间长等优点[2]。

    基因载体分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。非病毒性载体包括脂质体包被DNA、多聚体（多聚赖氨酸复合物等）和重组乳糜微粒残余体等。非病毒性载体具有载基因容量大和抗原性较小、毒性小较为安全的优点，但同时它存在效率低且表达功能基因持续时间短的缺点，因此目前研究和使用的病毒性载体占到全部载体的70%以上[34]。

    2.1  病毒性载体  目前认为，病毒性载体是基因转移最为有效的工具，而逆转录病毒（retrovirus）、腺病毒（adenovirus）和腺病毒相关病毒(adeno associated virus，AAV)是肝纤维化基因治疗中最有希望的载体。

    腺病毒载体为双链DNA分子，决定了其理化性质稳定这一最大特点。腺病毒载体既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞，腺病毒转送的目的基因产物表达量大，能达到治疗水平。鉴于这些优点，腺病毒载体在肝纤维化基因治疗的各个环节中得到了广泛应用。Qi等[35]构建了表达TGF?鄄β Ⅱ型受体胞外区的复制缺陷型腺病毒载体，以阻断内源性TGF?鄄β受体信号通路；Rederfeld等[36]将MMP?鄄9的突变体通过腺病毒载体转导入CCl4诱导的BALB/c小鼠体内，使其与TIMP?鄄1结合，达到敲减TIMP?鄄1的目的；Salgado等[33]构建缺陷型腺病毒介导非分泌性人UPA基因，诱导胶原酶表达。但腺病毒载体存在目的基因的表达持续时间短的缺点，同时由于腺病毒具有免疫源性，容易引起宿主的免疫反应和毒副作用[2，37]。

    AAV为单链非致病性DNA病毒，可定点整合入第19号染色体，在辅助病毒的协助下，AAV可进行产毒性感染。AAV既能感染正在分裂的细胞，也能感染相对静止的细胞，而且还能在体内长期表达，不致病且无毒性，因此被视为一种理想的载体[38]。Chen等[6]构建AAV介导的人IFN?鄄γ(hIFN?鄄γ)表达载体，抑制HSC的活化；Tsui等[39]将AAV介导的Ⅰ型亚铁血红素加氧酶基因(HO?鄄1)通过门静脉注射到肝纤维化动物模型中，均获得满意的转染效率和稳定表达。AAV的不足之处是载基因容量小，不能提供足够的载体空间而限制其应用。

    逆转录病毒属于有包膜的RNA病毒，根据其基因组的结构可分为两类：一类为简单的逆转录病毒，如小鼠白血病病毒（MLV）；另一类为较复杂逆转录病毒，如慢病毒(lentivirus，LV）属中的人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)。简单的逆转录病毒最早应用肝纤维化的基因治疗。由于它只能将外源基因转移至增殖分裂的细胞，而对静止细胞转录效果不佳，因此以往的学者不得不采用肝脏部分切除等损伤性手段来诱导肝细胞的分裂[40]，且病毒颗粒稳定性较差、容纳外源基因量小、易被补体迅速破坏等缺点限制了它的使用。

    慢病毒是逆转录病毒科的成员。目前分离的慢病毒主要有：HIV，马传染性贫血病病毒(eqine infectious anemia virus，EIAV)和猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)等。与其他逆转录病毒不同，慢病毒基因组结构复杂，除了含有gag，pol，env等3个结构基因以及5′端和3′端LTR结构外，还包括4个辅助基因vif，vpr，nef，vpu和2个调节基因tat和rev[41]。病毒载体经改构后，不在宿主细胞内繁殖，不会导致宿主细胞死亡，被感染的或转化的动物细胞能连续传代，因此可利用慢病毒作载体改变动物细胞的基因型，并遗传到子代。慢病毒载体最大的特点是在感染分裂期细胞的同时，还可以感染非分裂期细胞，并可在宿主体内长期表达，且不易诱发宿主免疫反应，安全性好。此外，由于慢病毒有强大的包装能力，一般认为可达8～10 kb，因此适用于多基因表达系统。多项在动物模型中进行的实验均表明，肝细胞对LV介导的基因转移易感，转入的外源基因可长期表达。Zahler等[42]研究发现，在原代培养的胎儿肝细胞中，LV的感染效率可以达到30%～40%。LV经过改造在体外可有效转导原代培养的大鼠肝细胞和原代培养的人肝细胞[43]。我们通过构建慢病毒介导的tTG基因RNA干扰质粒转染大鼠原代HSC，已获得稳定表达。基于在肝细胞基因转导方面所具有的良好特性，慢病毒载体在肝纤维化基因治疗中的应用已引起越来越多的关注，而且在不断的改进中其安全性也逐渐得到保障。

    2.2  载体的靶向性研究  选择肝脏特异性靶向性载体逐渐受到重视，由于肝外组织器官也可能存在作用的靶点，因此强调治疗作用的特异性、靶向性不但可以提高作用的效率而且可以降低对其他脏器的潜在毒性影响。研究证实，活化的HSC是唯一表达甘露糖?鄄6?鄄磷酸盐受体和Ⅵ型胶原受体的细胞[44]，因此，通过甘露糖?鄄6?鄄磷酸盐对药物进行修饰后可以达到靶向作用于HSC的目的。Inagaki等[45]发现，将载体启动子加入增强子序列COL1A2，在特异性增强子的作用下，外源基因仅在肝纤维化组小鼠活化HSC中表达，而在正常小鼠肝脏及其他器官中均未见表达。因此，进一步筛选针对肝脏实质和间质细胞高选择性靶向性载体用于肝纤维化基因治疗，将提高肝纤维化治疗的针对性和高效性，提高抗肝纤维化治疗的整体水平。

    总之，随着对肝纤维化分子机制认识的不断深入，肝纤维化的基因治疗已展现出良好的发展前景；同样，载体技术的发展也为提高肝纤维化基因治疗的靶向性、安全性和有效性提供了保障。但是，肝纤维化是多基因和多途径调控的结果，而且目前大多数基因治疗还仅仅局限在动物实验阶段。因此，肝纤维化的基因治疗研究任重而道远，采用多环节联合基因治疗以及进一步提高载体系统的靶向性和安全性，是肝纤维化基因治疗发展的重要方向。

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