创伤性截肢手术患者的护理
发表时间：2012-10-15 浏览次数：735次
【摘要】 目的： 探讨中国人群慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)患者螺旋酶抗原(helicase antigen，HAGE)基因启动子的甲基化状况和临床相关性。方法： 应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)技术对50例不同临床分期的CML患者骨髓标本HAGE基因启动子的甲基化状态进行检测。结果： 13例(26%)CML患者存在HAGE基因启动子的低甲基化改变，而24例对照均无HAGE基因低甲基化，两组比较差异有统计学意义(P=0.007)。HAGE基因启动子低甲基化改变与CML患者的年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、临床分期及染色体异常均无相关性(P>0.05)。慢性期、加速期和急变期患者中HAGE基因启动子低甲基化频率分别为25%(9/36)、25%(1/4)和30%(3/10)(P>0.05)。结论： HAGE基因启动子低甲基化是CML中的常见分子事件。
【关键词】 慢性粒细胞白血病; 螺旋酶抗原基因; 低甲基化
[Abstract] Objective： To study the methylation status of helicase antigen (HAGE) gene promoter and its clinical correlations in Chinese patients with chronic myeloid leukemia (CML). Methods： The methylation status of HAGE promoter in the bone marrow samples from 50 CML patients in different stages was detected using methylation-specific PCR (MSP) technique. Results： Hypomethylation of HAGE gene promoter was found in 13 (26%) CML cases， but not in all 24 controls (P=0.007). There was no correlations between the hypomethylation of HAGE gene promoter with the age， sex， white blood cell count， hemoglobin concentration， platelet count， clinical stages， and chromosomal abnormalities of CML patients (P>0.05). The frequencies of HAGE promoter hypomethylation in patients in chronic phase or accelerated phase， and in blast crisis were 25% (9/36)， 25% (1/4) and 30% (3/10)， respectively (P>0.05). Conclusion： Hypomethylation of HAGE gene promoter was a frequent molecular event in CML.
[Key words] chronic myeloid leukemia; helicase antigen gene; hypomethylation
螺旋酶抗原(helicase antigen，HAGE)基因是一新发现的候选癌基因，定位于染色体6q12-q13，编码一种肿瘤特异性抗原[1]，该抗原属于一种肿瘤/睾丸抗原。尽管HAGE的功能尚未明确，但已有研究报道HAGE高表达可见于43%的涎腺肿瘤、54%的慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)、23%的急性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，AML)、34%的多发性骨髓瘤、64%的淋巴瘤和其他实体瘤[2-6]。此外，Roman-Gomez等[7]对国外CML患者HAGE基因启动子甲基化的研究证实CML中HAGE启动子的低甲基化和高表达有关，并且和疾病进展及患者的不良预后有关。但中国人群CML患者中HAGE基因启动子的甲基化状况和临床相关性尚未见报道。我们应用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)方法对CML患者HAGE基因启动子甲基化状态进行了检测并评价其临床相关性。
1 对象与方法
1.1 病例
50例CML患者均为我院的门诊和住院患者，男30例、女20例，年龄15～83岁(中位年龄45.5)，其中慢性期36例、加速期4例、急变期10例，所有患者均依据《血液病诊断及疗效标准》[8]诊断并分期，均经染色体和(或)bcr/abl融合基因检测证实。来自本院的24例缺铁性贫血患者作为对照。
1.2 主要试剂和仪器
基因组DNA提取试剂盒购自Gentra公司;DNA甲基化修饰试剂盒购自加拿大Chemicon公司;Taq DNA 聚合酶购自Fermentas公司;pMD? 19T 克隆载体购自Takara 公司;DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA提取试剂盒购自Axygen公司;PCR引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PE 9600 PCR仪(ABI公司);iCycler梯度PCR仪(Bio-Rad公司);Gene Genius凝胶成像仪(Syngene公司)。
1.3 骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cell，BMNC)分离和DNA制备
所有患者和对照均抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，Ficoll液分离BMNC，按基因组DNA纯化试剂盒说明书提取基因组DNA，经核酸定量仪定量后立即修饰处理或-20℃保存备用。
1.4 DNA亚硫酸盐修饰
每例取DNA标本1 μg，按DNA甲基化修饰试剂盒操作步骤进行亚硫酸氢盐修饰处理，-80℃保存备用。
1.5 HAGE基因甲基化检测
采用MSP方法，参照文献[7]设计引物，HAGE基因甲基化(M)引物序列：上游引物5′-GGAGGAGTTTTTAAGGTTTTTACGT-3′，下游引物5′-GACAATTCCTCGTAACCAACG-3′;未甲基化(U)引物序列：上游引物5′-GGAGGAGTTTTTAAGGTTTTTATGT-3′，下游引物5′-ACAACAATTCCTCATAACCAACAA-3′。25 μl PCR反应体系包括2.0 mmol/L MgCl2、1×PCR缓冲液、上下游引物各200 nmol/L、1 U Taq DNA 聚合酶、200 μmol/L dNTP和2 μl修饰的DNA。PCR反应条件为94℃ 4 min预变性， 然后是94℃ 30 s、 61℃ 30 s、72℃ 30 s， 40个循环扩增，最后是72℃延伸7 min。每次实验中都设立经测序结果证实序列正确的M和U的质粒作为阳性对照，无模板DNA的蒸馏水作为阴性对照。PCR产物长度分别为194 bp(M)和196 bp(U)。扩增产物在30 g/L琼脂糖凝胶上采用100 V电压电泳1 h，在Gene Genius凝胶成像仪下观察并拍照。
1.6 PCR产物克隆测序
将PCR扩增后的M和U阳性产物纯化回收、克隆、提取质粒后送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果核对正确。
1.7 细胞遗传学检查
将初诊时采集的骨髓细胞采用直接法和24 h短期培养法制备染色体标本，然后进行R显带处理。按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》[9]进行核型分析。
1.8 统计方法
应用SPSS 13.0 软件进行统计学分析处理，病例组和对照组以及病例组中不同临床分期、性别或染色体分组中HAGE基因低甲基化频率的差异分析应用Pearson′s χ2检验或Fisher′s确切概率法，低甲基化阳性组与阴性组在患者年龄、血红蛋白含量、白细胞计数和血小板计数中的差异分析应用Mann-Whitney U检验，所有分析均设定P值为双侧分布，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CML患者HAGE基因启动子低甲基化频率
采用MSP方法检测50例CML患者，共有13例(26%)存在HAGE基因低甲基化，而24例对照均未显示HAGE的低甲基化改变，该差异具有统计学意义(P=0.007)。图1为HAGE基因的MSP电泳结果。对1例急变期患者的MSP M和U的阳性产物分别测序显示，M阳性产物中CpG二核苷酸中的CG未发生改变，仍为CG;而U阳性产物的CpG二核苷酸中的CG被硫化修饰为TG。CML患者中HAGE基因启动子低甲基化频率和患者年龄、性别、白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数及染色体异常分组均无相关性(表1)。
marker：100 bp DNA Ladder;1：阳性对照;2：1例缺铁性贫血患者标本;3：1例CML慢性期标本;4：1例CML加速期标本;5：1例CML急变期标本;6：空白对照;U：未甲基化;M：甲基化 图1 HAGE基因启动子甲基化特异性PCR电泳结果表1 HAGE基因启动子低甲基化与CML患者临床特征的关系
2.2 不同CML分期中HAGE基因启动子低甲基化频率
MSP结果显示36例慢性期患者中9例(25%)、4例加速期患者中1例(25%)、10例急变期患者中3例(30%)具有HAGE基因启动子的低甲基化，3组间的差异无统计学意义(P>0.05)。我们对1例患者慢性期和加速期标本进行了检测，结果显示该患者在慢性期HAGE基因为低甲基化阴性，而进入加速期后转为低甲基化阳性。
3 讨论
近些年DNA甲基化已经成为肿瘤研究的热点，但人们的研究焦点主要集中在抑癌基因，现已发现死亡相关蛋白激酶(DAPK)[10]、降钙素(CT)[11-12]等抑癌基因的高甲基化可能和CML的发生发展有关，而对癌基因的甲基化研究却很少。HAGE基因是一新发现的候选癌基因， 一些研究初步证实其在很多实体瘤和一些恶性血液病中高表达，可能与发病相关[2-6]。
我们的初步研究结果揭示中国人群CML患者中同样存在着HAGE基因启动子的低甲基化改变，与Roman-Gomez等[7]报道相近，但我们的研究并未发现随着CML疾病进展HAGE基因启动子低甲基化频率的明显增高，其原因可能有二： ① 本组病例尤其是加速期和急变期患者病例数偏少，尽管急变组中HAGE基因启动子低甲基化频率高于慢性期，但差异无统计学意义;② 可能在不同人种中CML疾病进展涉及的相关分子机制不尽相同，HAGE基因启动子低甲基化改变与中国人群CML的疾病进展并不相关;对更多病例以及不同人种CML患者的研究有助于解答这一问题。
此外，我们对1例CML患者不同时期标本的检测结果显示，慢性期HAGE基因启动子呈高甲基化状态，而进入加速期后则转变为低甲基化状态，这一结果提示HAGE基因启动子甲基化态势的检测可能有助于对CML患者的疾病状态进行监测。
我们的初步研究结果显示，HAGE基因启动子低甲基化改变是CML发生过程中的一个常见事件，但是否与CML的发病及进展相关还有待于进一步研究。
【参考文献】
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