慢性创面基因治疗研究进展

　　作者：陈绪斌,陈绪安　　作者单位：大冶市第三人民医院，湖北 大冶

　　【关键词】 慢性创面 基因治疗 基因导入

　　Research Evolution of Gene Therapy to Chronic Wound

　　CHEN Xubin,CHEN Xuan

　　(The Third People’s Hospital of Daye,Daye,Hubei 435006,China)

　　Key words:Chronic wound;Gene therapy;Gene guide

　　糖尿病足溃疡、皮肤慢性缺血性溃疡、放射性溃疡、藏毛窦等慢性创面，局部组织损伤严重、细胞生存环境变化大;虽然外科医生战战兢兢的手术刀治愈了一些患者，但手术创伤大、失败率高、致残率高。如何简单有效地治疗这类疾病，是创伤修复领域面临的严峻挑战。随着细胞分子生物学、免疫学、组织工程学及DNA分子操作技术的进步;细胞移植、组织工程皮肤移植、基因治疗等新治疗方法的开展，为慢性创面的修复带来了新的曙光。本文就慢性创面的病理生理以及基因治疗的有关研究综述如下。

　　1 慢性创面的病理生理

　　慢性创面往往延迟愈合甚至不愈合，其愈合受损(impaired healing)与创面以下病理生理机制有关。

　　1.1 细菌负荷(Bacteial burden) 慢性创面一个典型的特点是细菌大量定殖,有时是真菌或其他有机体。这可能与创面长期开放、血运障碍、氧供减少有关[1，2]。这种细菌定殖过程称为细菌负荷或生物负荷。组织中有机体数量超出怎样的水准将破坏创面的愈合过程还不清楚;但是，1 g组织中有机体数量超出106个将严重损害创面的愈合过程[3，4]。当压迫性溃疡长期不愈合时，有必要通过活检进行细菌学定量检测。减少创面细菌负荷具有临床和理论意义;但是，当大量有机体存在时，创面愈合过程受损的具体机制仍然知之甚少。最近人们对慢性创面可能存在的生物膜(biofilm)燃起了浓厚兴趣。这种膜在创面愈合受损甚至溃疡复发中起重要作用。生物膜其实是保护性多糖衣包被的菌落，极易抵抗抗生素的作用[5]。除此之外，还没有证据证实生物膜具有影响慢性创面愈合的其他作用。

　　1.2 生长因子扣押 各种慢性创面组织中，某些大分子，甚至生长因子被扣押在组织中，从而导致一些关键的生物调节因子(包括细胞因子)无法利用或异常分布[6]。生长因子、细胞因子、胞外基质的扣押具有触发病理性连锁反应的潜能，影响其下游调节因子的功能。漏到真皮层的大分子，如白蛋白、纤维蛋白原、β2巨球蛋白束缚生长因子的活性，从而破坏创面的正常愈合过程[7]。α2巨球蛋白是生长因子的猎食者，有研究显示，慢性创面组织中具有多种重要功能的转化生长因子β1被毛细血管周围的纤蛋白扣押[8]。

　　1.3 创口液与金属蛋白酶 创面保持湿润环境有利与再上皮化是过去50多年来我们在处理创面过程中所取得的重大认识[9，10]，各种保湿敷料相继涌现。虽然创面愈合湿润理论来源于急性创面，但这种经验也被推广到慢性创面。虽然创面保持湿润环境并没有增加感染率，但临床医生仍不免为之担心，使得创口液与创面保持接触是否是保湿敷料的主要作用，这点仍不是很清楚。慢性创面使用保湿敷料一个不确切的原因是慢性创面的创口液与急性创面的创口液具有截然不同的性质。急性创面的创口液在体外能刺激成纤维细胞、角元细胞、血管内皮细胞的增殖[11];相反，慢性创面的创口液妨碍了细胞的增殖、血管的生成;并且慢性创面的创口液含有大量的基质金属蛋白酶(MMPs)，可降解重要的基质蛋白，如纤连蛋白、波形蛋白[12，13]。毫无疑问，MMPs过度激活或异常分布将有碍创口的愈合[14，15];控制MMPs的数量和分布具有重要的治疗意义，如可增加创面局部生长因子的有效浓度。

　　1.4 血流减少与低氧血症 缺血导致组织坏死，进而形成创面，往往伴有感染。大量质料显示，低水平的跨皮氧分压(TcPO2)与创面不愈合有关[16，17]。TcPO2往往指导糖尿病足的治疗，决定截肢水平，诚然，缺血与缺氧不是一码事，有趣的是，从生物学观点看，缺氧能刺激成纤维细胞的增殖和某些生长因子的转录、合成[18]。然而同样有资料显示，高压氧也能使组织中VEGF的产生增加，很可能缺氧是损伤早期的刺激信号;但长期的低氧就可能导致在慢性创面所见到的瘢痕形成和纤维化等严重畸形。

　　1.5 创面细胞的表型改变 创面的正常愈合过程经历几个确定的阶段(炎症期、增生期、塑型期)，但慢性创面的愈合似乎没有确定的时间框架。越来越多的证据显示，慢性创面细胞的表型发生改变从而损害了其增殖、迁移能力。细胞对刺激的敏感性降低到那种程度还不清楚。糖尿病足溃疡创面成纤维细胞对生长因子的反应要么消失;要么需要一连串生长因子的作用[19]。其他慢性创面也观察到这种现象：如静脉性溃疡、压迫性溃疡的成纤维细胞增殖活力减弱;这种增殖活力的下降与创面的不愈合有关[20]。是否创面细胞的表型改变仅仅是体外现象;是否细胞的表型改变与创面延迟愈合或不愈合有关，直到现在还不是很清楚。

　　2 慢性创面基因治疗的优势

　　基因疗法是在基因水平通过基因转移方法，应用基因工程和细胞生物学技术，将遗传物质导入某类患者的特定细胞内，使导入基因表达，以补充缺失或失去正常功能的蛋白质，或者抑制体内某种基因过量的表达，达到基因替代、基因修正或基因增强、最终治疗疾病的目的。基因治疗目前主要是在遗传性疾病和恶性肿瘤的治疗中开展。目前转移的基因只能暂时表达，很难长期稳定表达，因而在要求基因长期表达的遗传性疾病的治疗中结果并不令人鼓舞!但创面的存在只是暂时的，基因的暂时表达就能起到治疗作用;皮肤是人体最大的器官，也是容易接受基因转移的靶器官，上皮与真皮细胞易于获取，易于转基因操作，也容易把转染基因后的细胞回植到皮肤;因此皮肤创面目前最适合基因治疗，是开展基因治疗的好场所。

　　利用皮肤进行基因治疗，主要是将一定的生长因子基因转染到角朊细胞或成纤维细胞，使之大量表达。利用高表达的生长因子对创伤愈合形成过程发挥影响，达到促进愈合的效果。生长因子是一系列具有多种功能的活性肽类物质,它们促进或抑制着细胞的增殖与分化,同时也是介导细胞与细胞间相互作用的重要物质。整个修复过程中,它们影响细胞的迁移、增殖和分化,调控着细胞的生长速度,引导和调整人类创伤愈合的反应。因此成为创面基因治疗中首选的治疗性基因[5～9]。正常伤口愈合初期时转化生长因子(transforming growth factor β,TGFβ) 、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 和胰岛素样生长因子(insulin  like growth factor,IGF)的释放,对细胞的趋化和促有丝分裂起作用,随后分泌更多的转化生长因子(TGFβ) 、碱性成纤维细胞因子(basic fibroblast growth factor , bFGF) 和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF) ,开始刺激成纤维细胞和内皮细胞的增殖,修复细胞聚集在伤口部位,合成和分泌细胞外基质(ECM) 成分。有鉴于此,各学者潜心致力于正确合理地使用重组生长因子,使源源不断引入临床应用的生长因子获得最大功效,创面愈合达到最满意的修复结局。但是使用外源性生长因子存在明显的不足：生长因子来源有限，提取过程复杂，价格昂贵;半衰期短，很快被创面局部的蛋白酶水解;无理想的载体，治疗的同时产生毒性作用;用于深部组织时，由于不易反复加入而效应不佳。基因疗法的兴起与发展提供了新的思路：将一定的生长因子基因转染入细胞内，使局部有效而稳定合成生长因子来促进组织修复，从而克服使用外源性生长因子的缺点。

　　3 慢性创面愈合中的基因导入

　　慢性创面愈合过程中,基因转移技术将治疗性基因插入细胞,使系统内基因持久或短暂地表达,合成并传递特异的蛋白进入伤口。作为暴露性的组织,皮肤是最适合进行基因治疗的器官。按具体手段可以把基因转移系统分成两大类,即病毒性载体系统和非病毒载体系统。

　　3.1 病毒载体导入系统 病毒载体系统又称生物性载体系统,用于基因治疗时应具备以下基本条件:携带外源性基因并能包装成病毒颗粒,介导外源基因的转移和表达,对机体不致病。因此,野生型病毒需要进行改装才能应用于机体。限于病毒的多样性及其与机体复杂的依存关系,目前应用于组织修复基因治疗的生物学传递系统有逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和疱疹病毒等等。

　　3.1.1 逆转录病毒载体(retroviral vectors) 逆转录病毒介导方式是最早用于皮肤基因导入治疗中的载体[21]。在离体情况下,利用逆转录病毒将人生长激素( human growth hormone , hGH) 有效地转染到角质(形成)细胞,被修饰的角质(形成) 细胞分泌有生物活性的hGH,在活体形成有分层的表皮。Breibart等[22]在离体的实验中显示,利用逆转录病毒载体将PDGF  B转染到鼠成纤维细胞后,可以促进伤口愈合。Supp等[23]利用该病毒把PDGF  A 转染入成纤维细胞和角质化细胞后同样改善创面的愈合。其主要的优点:高效感染分裂的宿主细胞,感染率约为100 %;与宿主基因组整合的前病毒基因组非常稳定;宿主较为广泛;当逆转录病毒进入血液后易被人体的补体系统灭活,安全性相对较高。影响逆转录病毒作基因载体的两个障碍是它只感染处于分裂期的细胞和基因整合到染色体的方式是随机性的。因此,引起所需要细胞转化的可能性很低。

　　3.1.2 腺病毒载体(adenoviral vectors) Liechty等[24，25]在皮肤创面的愈合过程中利用腺病毒载体转移基因,结果转基因的表达持续两周,转移至兔缺血性创面的PDGFBB基因使伤口的再表皮化程度增强。Takahashi等[26]运用该病毒载体成功地转运bFGF,使血管内皮细胞增殖、分化,形成新生血管,加速伤口的愈合。腺病毒载体的优点:95%以上的人类皮肤细胞均可以被其感染,不要求严格的细胞分裂形式,无需长时间的筛选;被裂解后并不引起亚型的改变;很少被整合入人类基因组。主要缺点:载体产生免疫反应过强会造成毒性反应,甚至细胞死亡。

　　3.1.3 腺伴随病毒载体(adenoassociated viral vectors,AAV) Hengge等[27]实验证实AVV载体包含LacZ基因,经活体注射后可使β 半乳糖苷酶的表达超过6周,更让人有兴趣的是它不仅表达于表皮的角质化细胞,而且在汗腺及毛囊上皮细胞中表达,这对未来获得完美皮肤(不仅有真、表皮,而且含有皮肤的各种附属器) 的再生意义重大。此载体的主要优点是能获得长效的转基因表达,引起的宿主免疫反应极小。最大缺陷是包裹能力不超过4.5 kb;复制和包装需要辅助病毒(如腺病毒)。为避免腺病毒强烈的免疫原性和毒性,腺伴随病毒载体必须纯化,辅助病毒应该游离。

　　3.1.4 I型单纯疱疹病毒载体(HSV1) 由于单纯疱疹病毒在上皮细胞中复制的特性,它可在感染的个体中长期地潜伏。能感染有丝分裂和有丝分裂后期细胞,I型单纯疱疹病毒作为有潜力的遗传载体,已经引起人们的注意。为确保其安全性,新构建的抗HSV1特异性HSV1重组病毒CJ83193能抑制自身及母体野生型的病毒复制体,降低细胞毒性。目前已有成功利用该载体将bFGF传递入靶细胞,进行有效的基因治疗的报道[28]。随着基因治疗研究的快速发展,对基因导入系统提出了越来越高的要求。病毒载体的发展更是日新月异,其发展方向可归纳为:简便高效的病毒载体包装系统;无病毒基因的病毒载体;可调控表达外源基因的病毒载体;自我扩增型载体;特异性复制型病毒载体;嵌合型病毒载体;靶向性病毒载体。

　　3.2 非病毒载体导入系统 由于非病毒载体导入系统没有病毒系统本身固有的缺点(如抗原性、持续或反复暴露病毒载体导致的细胞损伤、治疗性基因容量小和制备复杂等) ,越来越受到人们的重视。裸DNA 外用、质脂转染和受体介导的转移载体是较为常用的非病毒导入系统。

　　3.2.1 裸DNA(naked DNA) 裸DNA是最简单的非病毒载体,与其他载体的基因转移相比,其转染效率较低,但在某些条件下,质粒DNA传递的基因表达足以产生明显的临床反应。近几年,局部皮下微量注射、电穿孔(强电流将外源性DNA引入细胞的基因转移方法)、超声波等技术,都取得极大进步。其中粒子介导基因转移(particlemediated gene transfer)即基因枪技术运用最为普遍。一般情况下,皮肤在辐射后1 d～3 d后达到高峰,转基因mRNA水平在1周后降至最低,而转基因DNA持续的时间较长。Andree等[29]证明,活体条件下,利用粒子介导基因转移技术人们成功地将编码人EGF的质粒DNA直接导入全层缺损的皮肤伤口,与对照组相比,伤口愈合速度明显加快,再上皮化增强。Nanney等[30]也证明,利用基因枪使EGF在伤口的表达增加,将增强细胞的增殖、增加肉芽组织形成,促进伤口愈合。最近已有PDGF、TGFβ、FGF、VEGF等多种生长因子被新型的粒子轰击技术成功地转运到受伤的皮肤组织中,以加速创面的愈合[31]。该方法用于皮肤有以下几个优点:技术简单,标准性和可再生性好;制剂极其稳定,支架的活力在6个月以上;不含有外源性蛋白。但较高的氦压力(400 Pa～700 Pa)加速微粒子进入表皮组织,对肉芽组织造成损害。

　　3.2.2 阳离子脂质体(cationic liposomes) Sun等[32]将生长因子编码的质粒/质脂复合物成功地转移到创面。糖尿病鼠的伤口表面运用15 d重组的aFGF,与之相比,连用3 d质脂/aFGF编码的质粒能加速创面的愈合。Taub等[33]1998年在鼠的缺血性皮瓣成活模型中证实,质脂体能增加VEGF表达的AAV基因转移,在腹部皮瓣注入大量的质脂/AAV表达的VEGF,成活的皮瓣面积达94%,而对照组只有28%～32%。该载体主要的优点是免疫原性较低,可反复给药。制约其应用的是活体中的转染效率低,制备不稳定,及对靶细胞的毒性和试剂价格较贵等。

　　3.2.3 微种植技术(microseeding) 微种植技术是将手提式纹身机装置进行改装,利用一系列实心的震动性微针将目的基因导入靶细胞。基因表达的量通过目的基因浓度和溶解物到达针尖的量来调整。Eriks2son[34]用微种植技术是将目的基因转移到皮肤,经微种植后,全层皮肤伤口内生长因子所产生的量比用基因枪对伤口进行粒子轰击的量要高出3倍。比单纯注射的基因导入方法的量要高7倍。若把质粒DNA作为DNA脂质转染剂复合物转移至皮肤,微种植技术的基因转移效率将进一步增强。因此,它是单纯性注射和粒子介导的基因转移方法的进一步发展。质粒DNA转移到每个靶点的量可在100 μg以上,而穿透的组织深度达5 mm。由于不需要特殊的准备,微种植技术有效地把重组的病毒载体(如腺病毒载体) 转移到皮肤伤口的研究正引起国内、外极大的关注。以上方法的结合使用会收到更好的效果,转移效率可进一步提高。只要我们深入探讨和研究细胞摄入DNA的机制,就有可能找到理想的生理转基因途径和方法。

　　4 基因治疗中治疗性基因表达活性的维持

　　当前生长因子无法成功地运用于创面的修复,除了基因导入系统对治疗性基因活性的影响,与伤口环境中蛋白酶的对抗作用有很大关系。大多数的实验显示,进入角质(形成)细胞的质粒能够获得理想的基因表达,而无论是活体表达PDGF2A的被修饰细胞移植至皮肤以增加伤口的愈合,或是质粒DNA编码的EGF、TGF2β和PDGF2B转移至皮肤,深入到真皮组织的质粒都会因基质的作用利用率下降,无法彻底改变转移效率较低的问题。Chandler用生物适合的可降解基质转移DNA载体,改善对组织修复中基因治疗的影响,该研究被称之为基因活性基质(Gene activated matrix,GAM)。利用基质介导传递的基因治疗,DNA载体及转基因产物滞留在缺损部位,减少了载体转移至非需要正常组织的可能性,增加了获得最大治疗效果反映的机会。Shea用包含一个质粒编码PDGF2Bb的基质移植到皮下,增加创面肉芽组织和血管的形成。GAMs能够根据不同的治疗靶组织选择不同的基质和治疗性基因,使基质在治疗部位保留载体,组织修复细胞吸收后表达转基因。

　　5 治疗性基因的表达调控

　　伤口的愈合是一个暂时性的过程,因此基因高水平的表达必须限定在一个时期之内。如何精准地调节生长因子水平,控制其过量表达的毒性作用,已成为一项越来越受关注的工作。利用四环素开关控制hEGF表达已取得某些进展,修饰性细胞移植到猪的全层皮肤缺损创面后,hEGF表达水平达到80 ng/ml,与缺乏修饰细胞的对照组相比,hEGF的表达不仅超过1 000倍,而且有四环素出现的伤口能够被有效的调控。利用反义寡脱氧核苷酸对治疗性基因翻译水平的调控,从而完成潜在性的基因表达调节,也成为当前人们研究的一个重点。但最理想的调控应该是模拟人体内基因本身的调控形式,唯有如此,才能达到定点插入(knock in)、生理性调控的目的。目前,脂粒和一般的噬菌体很难达到这样的要求。因此,基因治疗调控将是人们长期的追求目标。

　　6 创面愈合基因治疗尚待解决的主要问题

　　6.1 安全性 目前有关基因疗法应用于创面愈合的安全性问题尚未完全解决。它包括两方面内容,一是本身的安全性,二是转基因事件发生后目的基因在体内受控的安全性。目前,尽管毒性较高的重组腺病毒技术已较少应用,而非病毒转导的脂质体技术与基因枪技术以及重组逆转录病毒技术已获得较广泛应用,但应用后引起的局部炎症反应、流行性感冒样综合征以及整合入外源性DNA可能导致的恶性转化等改变仍值得人们注意。加之这些常用的技术存在转染的DNA片段小,或目的基因表达短暂,或整合的DNA稳定性较低等因素,故在用于人体时,其方法学的安全性仍然受到怀疑。另一方面,转导入体内后,目的基因的可控性是安全性考虑的另一重点。从创面愈合的生理学来讲,许多与修复有关的生长因子的基因和蛋白在正常条件下处于“失活”的储存状态。当损伤发生后,部分参与组织修复的生长因子基因激活与表达上调也仅仅发生在修复的某一阶段,呈有序而可控,而非持续的激活与表达。尽管一般转染基因表达的时间仅为数天或2周～3周,但近来有实验报告,某些转基因研究的目的基因在体内表达可持续5周甚至8周以上。目前尚没有外源性基因转导入修复组织后受调控的详细报告,特别是转入的外源性基因与组织相同的内源性基因之间的相互关系尚不清楚。因此,人们担心一旦导入的外源性基因发生失控将产生灾难性后果。

　　6.2 实用性 实用性研究是基因疗法走向临床应用的重要环节。尽管目前所采用的非病毒转导技术与病毒转染技术已有其实用价值,但距方便、快捷的临床应用还有一定差距,大部分仍停留在实验室阶段。以脂质体转导技术为例,它需要将细胞分离,经体外培养、修饰后再移植回体内,对培养条件与移植技术有一定要求,并且治疗将花去较长的时间。再如体外法,可利用基因枪技术将目的基因制成带电颗粒,在高压电泳的作用下直接穿透细胞膜进入细胞,在细胞自身生理机制作用下整合到宿主染色体上,形成稳定的表达。但这种方法也有其明显的局限性,即目的性较差。因此,对于创面愈合这一类目前看来是一种非单基因缺陷性遗传性疾病的治疗采用如此复杂技术的实际意义值得考虑。

　　除此之外,鉴别靶细胞、基因转移的效率、表达期的调控、重复治疗等技术方法的解决仍是目前影响其临床应用的主要障碍。

　　7 展望

　　虽然基因治疗目前的成就离人们所希望的结果尚有较大差距。随着物理、化学和生物学方法的发展,以及人类基因组知识的扩展,把基因传递到哺乳类动物细胞内的技术还会有进一步的提高,利用基因技术治疗创面愈合与组织修复正在变为现实。这种新技术、新方法以及新思路的出现,将会给临床治疗带来一场革命性突破。

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