G-CSF动员循环间充质干细胞及其对小鼠颅脑损伤修复的可行

　　作者：邓均1,艾国平1,周桃莉2,王军平1　　作者单位：(第三军医大学:1军事预防医学院防原医学教研室,全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,2基础医学部病原生物学教研室,重庆400038)

　　提　要:目的　建立小鼠严重颅脑创伤模型探讨粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)动员循环间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的可行性,并观察G-CSF动员的修复效应。方法　以G-CSF作为动员剂,培养骨髓和外周血来源的MSCs,计数动员前后的CFU-F。制作小鼠严重颅脑创伤模型,致伤后采用G-CSF对MSCs进行动员,在2、24、48、96、120、144、192、264、336 h进行神经行为学评分、运动功能评分,并观察小鼠死亡率和病理组织切片。结果　从小鼠外周血培养出MSCs, G-CSF动员后骨髓和外周血MSCs的CFU-F数量显著高于正常对照组(P<0•01)。致伤后小鼠神经行为学和运动功能评分显著低于正常对照组(P<0•01),创伤治疗组在144~192 h期间评分显著高于创伤组(P<0•05)。致伤后小鼠死亡率增高,病理切片可见创伤处有出血和空泡。结论　成功培养及用G-CSF动员了外周血MSCs,在成功建立小鼠严重颅脑创伤模型的基础上,显示G-CSF动员可以降低严重颅脑创伤小鼠死亡,参与了创伤修复。

　　关键词:间充质干细胞;创伤;动员;G-CSF

　　中图法分类号:R329. 21;R331. 22;R651. 15文献标识码:A

　　Feasibility ofM SCs mobilization by G-CSF and its prosthetic effect in traumatic

　　brain injuryDENG Jun1,AI Guo-ping1,ZHOU Tao-li2,WANG Jun-ping1,XU Hui1,ZOU Zhong-min1,DONG Shi-u1,HAOLei1,RAN Xin-ze1,SUYong-ping1(1State Key Laboratory ofTrauma,Burns and Combined Injury,Institute ofCombined Injury,College of Preventive Medicine,2Department of athobiology,College of Medicine,Third M ilitary Medical University,Chongqing400038,China)

　　Abstract:Objective　To explore the feasibility ofmobilization circulatingMSCs by G-CSF and observethe repairing effectofG-CSF mobilization in severe mouse traumatic brain injury(TBI)mode.lMethods　MSCs-derived bonemarrow and peripheralblood(PB)were cultured and itsCFU-Fwere counted aftermobilization byG-CSF. At2,24,48,96,120,144,192,264,336 h after severeTBI inmicewas establish,theneurobehavior ofmicewasmeasured by neurological examination and motor functional test,and mortality rateand pathologic changeswere analyzed.Results　MSCs-deived PB were successfully cultured. The CFU-F ofmobilization group increased significantly than thatofcontrolgroup(P<0•01). AfterTBI,the neurobehavioralandmotor function scores decreased significantly as comparedwith thatofnormalgroup(P<0•01),the scoresof treatmentgroup increased significantly as comparedwith thatof trauma group(P<0•05). Themortality ratewas high afterTBI,and brain injury such as haemorrhage and vacuoluswere confirmed by patologic examina-

　　tions.Conclusion　G-CSF canmobilizeMSCs-derived PB. G-CSFmobilization can decrease the death ofTBI

　　mice and participate repair in trauma ofTBImice.

　　Key words:mesenchymal stem cell;trauma;mobilization;G-CSF

　　在交通伤和战伤中颅脑外伤(traumatic brain injury,TBI)的发生率较高。TBI是导致患者伤残和死亡

　　的主要原因之一,占全身伤的10% ~20%,其病死率可高达35% ~60%。间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)对中枢神经系统损伤的治疗是新近发展起来并极有前景的治疗策略。它通过动员内源性循环干细胞进行创伤修复,但外周血能否培养出MSCs[1, 2]及MSCs能否被有效动员仍存在着争议。本实验旨在建立小鼠严重颅脑撞击伤模型后进行粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)动员,并对小鼠致伤后神经行为学、运动功能及死亡率进行观察,以评估G-CSF动员在TBI中的修复效应。

　　1　材料与方法

　　1. 1　实验动物及主要试剂

　　SD大鼠8只,雌雄各半, 2月龄,体质量约200 g,由第三军医大学实验动物中心提供。C57BL/6小鼠58只,鼠龄1个月,体质量约25 g,由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。MEM /F12培养基、胎牛血清(Gibco, USA),G-CSF (齐鲁制药有限公司)。

　　1. 2　G-CSF动员外周血循环MSCs

　　1. 2. 1　实验分组及动员　　8只SD大鼠被分成2组,每组4只。对照组连续5 d尾静脉注射0. 5 mlNaCl(0. 9% )。动员组连续5 d尾静脉注射0. 5 ml 20μg/kg的G-CSF[3]。5 d后,收集外周血和骨髓样本进行MSCs培养。

　　1. 2. 2　动员后MSCs的培养

　　从大鼠股骨获得MSCs。具体操作为:分离股骨,清除股骨周围软组织。用MEM /F12 (含20%胎牛血清)培养基冲洗股骨头,制成细胞悬液,计数后以5×105/cm2密度接种于培养瓶,放入5% CO2、37℃孵箱。48 h后全量换液,去除悬浮细胞,以后3~4 d半量换液。细胞达80% ~90%融合后,用0. 25%胰酶消化传代。

　　剪开大鼠股动脉,用肝素化管收集5 ml外周血。用percoll(1. 131 g/m)分离单个核细胞,制成细胞悬液,计数后以6×105/cm2密度接种于培养瓶,以后方法同上。

　　1. 2. 3　成纤维集落形成单位( colony forming units-fibroblast,CFU-F)分析

　　细胞消化后(第1代)以105总量接种于25cm2的培养瓶,培养液为含15%胎牛血清的MEM /F12,放入5% CO2、37℃孵箱。48 h后全量换液, 7 d后,计数成纤维细胞集落形成单位(含50个以上细胞)。

　　1. 3　小鼠严重颅脑创伤模型制作

　　1. 3. 1　实验分组　　将58只C57BL/6小鼠被分为3组,正常对照组(N)8只:不作处理;创伤组(T)25只:创伤后连续5 d尾静脉注射0. 2 mlNaCl(0. 9% );创伤治疗组(TC)25只:创伤后连续5 d尾静脉注射含0. 8μgG-CSF的生理盐水0. 2ml(参考剂量为40μg•d-1•kg-1)。

　　1. 3. 2　模型制作

　　参考Marmarou[4]模型(大鼠颅脑创伤)的制作,并经过改进。用1%戊巴比妥0. 1 ml将小鼠麻醉,固定在木板上,颌下垫软垫,头部戴上自制的头盔(接触部位用牙托粉塑形),对准重物下降通道钢管口下端,用50 g重物从30 cm高度沿下降通道钢管自由落体,即以50 g×30 cm的力量撞击小鼠头部,制成小鼠严重颅脑创伤模型。

　　1. 3. 3　观察项目

　　于致伤后2、24、48、96、120、144、192、264、336 h测定神经行为学评分、运动功能评分、并作致伤后死亡率、病理切片观察证实伤情。

　　1. 3. 4　神经行为学评分

　　参照Bederson等[5]评分方法,改进后设计出神经行为学评分(表1)。

　　表1　神经行为学评分标准(0~16分)

　　评价计分

　　检查项目

　　部位正常计分缺失计分

　　抓握反射左前爪1 0

　　右前爪1 0

　　左后爪1 0

　　右后爪1 0

　　反正反射左侧1 0

　　(头倾斜)右侧1 0

　　视觉1 0

　　放置反射肢体悬吊左前爪1 0

　　右前爪1 0

　　左后爪1 0

　　右后爪1 0

　　本体感受检查肢体肌肉受刺用爪推离1 0

　　角膜反射角膜1 0

　　耳廓反射触及耳道引起头部摇动1 0

　　不正常姿势胸部扭曲　　1(无) 0

　　前后肢屈曲　　1(无) 0

　　1. 3. 5　运动功能评分

　　参照Shapira等[6]评分方法,改进后

　　设计出运动功能评分(表2)。

　　表2　运动功能评分标准(0~11分)

　　检查项目运动功能表现评价计分

　　行走实验

　　(宽2. 5 cm木条)

　　行走自如,无缺陷3

　　行走乏力,四肢支撑面宽2

　　跌下或滑倒1

　　不能爬行0

　　平衡实验

　　(宽1. 0 cm木条)

　　行走、平稳自如6

　　抓握木条一边5

　　紧靠木条, 1肢掉离4

　　紧靠木条, 2肢掉离或自转3

　　试图平衡,大于40 s 2

　　试图平衡,大于20 s 1

　　停留小于20 s或没有试图平衡0

　　爬坡实验(粗糙木板与

　　水平成60°)

　　停留大于10 s 2

　　停留5~10 s 1

　　停留小于5 s或不能停留0

　　1. 4　统计学方法

　　数据用-x±s表示,采用SPSS 11. 0软件进行统计学处理,组间各时相点比较用t检验。

　　2　结果

　　2. 1　MSCs的培养

　　成功培养出外周血来源的MSCs,经过CFU-F分析显示,G-CSF动员后骨髓来源MSCs的CFU-F数量显著高于对照组的CFU-F (P<0•01)。其对照组和动员组的值分别为(29. 50±3. 87)和(49. 75±4. 57)。经G-CSF动员后外周血来源MSCs的CFU-F数量也显著高于对照组的CFU-F数量(P<0•01)。其对照组和动员组的值分别为(7. 25±1. 26)和(24•75±2•63)。

　　2. 2　严重颅脑创伤小鼠神经行为学和运动功能评分

　　在本实验条件下, 50只小鼠致伤后呼吸、心率抑制明显,立即死亡22只,剩下28只小鼠分为创伤组和创伤救治组各14只。神经行为学评分显示,T组评分显著低于N组(P<0•05),TC组在192 h以前评分显著低于N组(P<0.05),并在144~192 h评分显著高于T组(P<0•05,表3)。运动功能评分也显示,T组评分显著低于N组(P<0•01,2周时为P<0•05),TC组在192 h以前评分显著低于N组(P<0•01, 192 h时为P<0•05),并在120~192 h期间评分显著高于T组(P<0•05,表4)。

　　表3　小鼠致伤后神经行为学评分(-x±s)

　　组别n2 h 24 h 48 h 96 h 120 h 144 h 192 h 264 h 336 h

　　N 8 15. 25±0. 707 15. 38±0. 747 15. 25±0. 707 15. 57±0. 535 15. 43±0. 787 15. 29±0. 756 15. 29±0. 756 15. 43±0. 787 15. 71±0. 488

　　T 14 9. 29±1. 590a10. 07±1. 774a10. 14±1. 834a10. 14±1. 703a10. 83±1. 851a10. 73±1. 737a11. 29±1. 800a13. 33±1. 633b13. 83±1. 722b

　　TC 14 8. 93±1. 817a9. 57±2. 102a10. 21±1. 578a11. 23±2. 048a11. 25±1. 658a12. 33±1. 614ac13. 20±1. 687bc14. 30±1. 494 14. 50±1. 789

　　a:P<0•01,b:P<0•05,与N组比较;c:P<0•05,与同时相点T组比较

　　表4　小鼠致伤后运动功能评分(-x±s)

　　组别n2 h 24 h 48 h 96 h 120 h 144 h 192 h 264 h 336 h

　　N 8 10. 50±0. 756 10. 50±0. 756 10. 75±0. 463 10. 29±0. 488 10. 43±0. 535 10. 71±0. 488 10. 57±0. 787 10. 57±0. 535 10. 71±0. 488

　　T 14 6. 57±1. 343a6. 43±1. 399a6. 71±1. 069a6. 93±1. 072a6. 83±1. 267a6. 91±1. 300a7. 57±1. 512a8. 83±0. 753a9. 17±0. 983b

　　TC 14 6. 36±1. 216a6. 86±1. 027a6. 93±1. 207a7. 00±1. 291a7. 92±0. 996ac8. 17±1. 337ac9. 00±0. 817bc9. 70±1. 160 9. 60±1. 174

　　a:P<0•01,b:P<0•05,与N组比较;c:P<0•05,与同时相点T组比较

　　2. 3　致伤后累计死亡率

　　致伤后有44%的小鼠即刻死亡,不计入其中。致伤后T组和TC组的累计死亡率高于N组,TC组又低于T组。

　　2. 4　病理组织观察

　　致伤后10 d死亡小鼠的大脑冠状切面,病理切片(HE染色)可见脑组织出血、脑组织细胞肿胀,组织中有大量空泡出现(图1)。

　　图1　小鼠致伤后10 d大脑皮层组织病理变化　(HE×400)

　　3　讨论

　　近来的研究表明,骨髓来源干细胞是组织损伤修复的有效细胞来源,并有研究证实在胎儿和新生儿血液中存在着循环MSCs[7],但从外周血中分离MSCs因受实验人员、环境、方法等影响,有成功也有失败的[1, 2]。本实验证实,在我们的实验条件下,可以从外周血中分离、培养出MSCs。但由于MSCs只是少量存在于循环血中,要达到细胞治疗的目的,还必须外来因素刺激动员骨髓内的MSCs进入循环血。G-CSF作为经典的动员剂已经大量运用于临床治疗。但大多研究者认为它能动员的是造血干细胞,而是否能动员MSCs或其他干细胞还不清楚。CFU-F被认为是比较成熟的MSCs后代和间质的前体细胞,CFU-F分析可用来评估培养体系中MSCs的数量。本实验通过CFU-F分析,证实G-CSF能动员骨髓来源的MSCs和外周血中的MSCs(接近4倍)。这为后续实验提供了实验依据。

　　我们参考Marmarou大鼠创伤模型,通过改进建立了小鼠严重颅脑创伤模型。为了达到严重颅脑创伤的

　　效果,本研究采用50 g重物从30 cm自由落体,打击力量可表示为50 g×30 cm。当场即时死亡率达到44%。致伤后小鼠神经行为学评分和运动功能评分都显著低于正常对照小鼠的评分;致伤后小鼠的累计死亡率也高于对照组;病理切片显示致伤后小鼠大脑出现脑组织出血、脑组织细胞肿胀,并有大量空泡出现,这些都表明小鼠严重颅脑创伤模型的成功建立。通过连续5 d的G-CSF动员,神经行为学评分显示,TC组在144~192 h期间评分显著高于T组(P<0•05),运动功能评分也显示TC组在120~192 h期间评分显著高于T组(P<0•05)。TC组的累计死亡率明显低于T组,这些证明G-CSF动员后,可以通过动员循环MSCs,对严重颅脑创伤小鼠有一定的创伤细胞修复效应,其中的具体修复机制也是我们需要进一步探索的。我们前期实验已证明伤口微环境能趋化MSCs在创面的优势分布[8],为本实验中MSCs能到达脑创伤部位并参与修复提供了理论依据。G-CSF大量应用于白血病的临床动员治疗,已证明其安全性,本实验也为G-CSF动员在严重颅脑创伤临床治疗的应用,提供极为重要的基础理论依据。

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