大黄对大鼠实验性创伤性脑水肿的影响

　　作者：段英杰　　作者单位：辽宁医学院附属第一医院神经外科，辽宁 锦州 121001

　　【摘要】目的研究大黄对大鼠脑创伤后脑水肿的影响，进一步探讨其对实验性创伤性脑水肿的防治作用和可能机制。方法 SD大鼠96只，随机分成3组，假手术组、模型组、大黄治疗组。每组分4个时间点：1、3、5、7 d，每个时间点各8只。除假手术组外，各组大鼠复制Feeney自由落体大鼠脑外伤模型。其中，治疗组大鼠造模后给予大黄500 mg/(kg•d)灌胃。各组大鼠分别在1、3、5、7 d处死，分别测量脑含水量;观察各组脑组织的超微结构以及应用western blot测量各组大鼠AQP4的表达。结果 脑外伤后与模型组相比，大黄组脑组织含水量明显减少;通过电镜观察提示，大黄组毛细血管周围星形胶质细胞足突肿胀减轻，线粒体等细胞器完整。另外，模型组创伤后第1 dAQP4的表达略升高，而到第3 d达最低，从第5 d起AQP4的表达逐渐升高，第7 dAQP4的表达仍高于假手术组。在颅脑创伤早期以血管源性脑水肿为主的第1、3 d时，大黄组AQP4的表达较模型组上调，对脑水肿起保护作用，在第5、7 d细胞毒性脑水肿出现后大黄可明显抑制AQP4的表达减轻脑水肿。结论 大黄可减轻创伤性脑水肿;它可能是调节脑外伤后创伤脑组织周围的AQP-4的表达来实现的。

　　【关键词】 创伤性脑水肿 大黄 AQP4

　　Impact of Rhubarb on Traumatic Brain Edema of RatDUAN Yingjie1, LIU Xingbo1，MO Li2 (1.Department of Neurosurgery ,the First Affiliated Hospital, Liaoning Medical University , Jinzhou 121000 China; 2.Department of Nephrology,General Hospital of Mining Industar Group of Fuxin,Fuxin 123000 China)Abstract：Objective This thesis aims to investigate impact of rhubarb on traumatic brain edema and study its prevention and possible mechanism of experimental traumatic brain edema . Methods 96 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: normal contrast group, model group, and Rhubarb treatment group. There were 4 observational time points in each group:1, 3, 5 and 7 days with 8 rats in each time point. Rats were copied free fall injury model in rats except normal contrast group.Then rats in treatment group were given Rhubarb (500mg /kg•day) by gastric perfusion. At the time of 1,3,5,7 days,8 rats in each group were sacrificed to detect the brain water content, the ultra structure of brain tissue was observed with electron microscope and AQP4 protein expression was measured with Western blot.Results Rhubarb showed effects in reducing cerebral edema and relieved astrocyte end feet process swelled obviously .There were basically complete organelle structure such as Mitochondria with electron microscope. The AQP4 protein expression in rats increased slightly on the 1st day after modeling and reached the lowest levels on the 3rd day , and then increased gradually on the 7th day, the AQP4 protein expression is still higher than the normal contrast group. At early stage , Rhubarb could up-regulate AQP4 protein expression when Vasogenic Brain Edema dominated to have protective effect on brain edema. On the 5th,7th day, Rhubarb could inhibit AQP4 protein expression to alleviate cerebral edema after cytotoxic brain edema appeared. Conclusion Rhubarb could alleviate cerebral edema, and it could be realised by regulating AQP4 expression after traumatic brain injury.

　　Key words： traumatic brain edema;Rhubarb; AQP4

　　创伤性脑水肿是继发于颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)后出现的最重要的病理生理反应，一般系指血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿的混合而言，是创伤致死和致残的主要原因。创伤性脑水肿的发病机制是多因素的，至今并未完全得到阐明。近年人们发现水通道蛋白-4(aquaporin-4，AQP4)与脑水肿有密切关系[1]。国内外学者在通过对AQP4敲除大鼠的研究，已证实了AQP4参与细胞毒性脑水肿的形成[2，3]，并可能对血管源性脑水肿的清除起重要作用[4]。

　　大黄性味苦寒，入脾胃、大肠、肝与心经，是一味传统中药。目前有研究显示，大黄对脑缺血[5]、脑出血[6]所致的细胞毒性脑水肿有明显的治疗作用。国内顾建文[7]等人通过对大黄治疗重型颅脑损伤的临床观察，证实大黄对重型颅脑损伤具有多靶点治疗作用。而其对创伤性脑水肿治疗方面的基础性研究少见报道。为此，本文采用Feeney自由落体大鼠脑外伤模型，研究大黄对大鼠脑创伤后脑水肿的影响，进一步探讨其对实验性创伤性脑水肿的防治作用和可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠96只，6～8周龄，体重220～250 g，由辽宁医学院实验动物中心提供(许可证号SCXK(辽)2003—0007)。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 大黄粉，由辽宁医学院附属第一医院试剂室提供;伊文氏蓝购于武汉博士德试剂公司;AQP4抗体购于美国Santa Cruz公司;SABC试剂盒购于武汉博士德试剂公司 ;自由落体打击装置;ZS-83组织匀浆机;RC5C 高速冷冻离心机;DYY-III37B等电聚焦电泳槽;JEM-1200EX透射电镜。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组 取健康雄性成年SD大鼠(清洁级)，随机分成3组：假手术组、模型组、大黄治疗组。每组分4个时间点：1、3、5、7 d，每个时间点各8只。大鼠适应性喂养3 d后用于造模。取10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g体重)后，将大鼠固定于立体定位仪上，行头部正中纵行切口，剥离骨膜暴露前囟和矢状缝。参考Feeney自由落体大鼠脑外伤模型，在大鼠前囟后方1.5 mm，中线右侧2.5 mm处钻开一直径为5 mm的骨洞，保持硬脑膜完整，将自由落体装置底座置于右顶部骨窗的硬脑膜表面，20 g法码从30 cm高处自由坠落至金属圆柱体表面，击中打击棒，下陷深度为0.25 cm，致大鼠中度脑损伤。用锌汀粉封闭骨窗，缝合头皮。置鼠笼喂养。其中，治疗组大鼠分别给予大黄，每天500 mg /kg灌胃。各组大鼠分别在1、3、5、7 d处死，进行指标的测量。

　　1.2.2 脑含水量测定 采用干湿法测定。精确称取脑组织湿重，取损伤侧大脑半球准确称重后，置于100～110 ℃的烤箱中烘烤24 h 至恒重后，称取干脑重，根据以下公式计算脑组织含水量百分比:脑组织含水量(%) = (湿重- 干重) / 湿重×100%，精确度为0.1 mg。

　　1.2.3 超微结构观察：将造模成功后各个时段大鼠经左心室先灌注生理盐水200 mL，然后再缓慢灌注2%戊二醛100 mL ，致右心耳流出液清亮，迅速开颅取脑，放入3%戊二醛中。经1%锇酸后固定，系列丙酮脱水，环氧树脂618 原位包埋，超薄(厚60 nm) 切片，醋酸铀染色，置于透射电镜下观察、拍片。

　　1.2.4 Western印迹方法测定AQP4蛋白 将造模成功的各个时段大鼠，取脑血肿周围皮层组织，缓冲液冲洗干净，30秒内置于-70 ℃冰箱。应用Western blot法对AQP4在大鼠脑组织外伤后各个时段的表达进行定量观察。

　　1.2.5 统计学方法 用SPSS 12.0 统计软件对计量数据进行分析。数据需经正态分布检验。若参数检验的假定合理，则多组间用单因素方差分析，两组间用两样本q检验。P< 0.05，P< 0.01结果具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 脑含水量的检测 见表1。模型组1 d创伤性大鼠脑含水量即开始上升( P< 0.05) ，3 d达到高峰;大黄组在1 、3 、5 、7 d与模型组比较差异有显著性(P< 0.05)。表1 各组大鼠在1，3，5，7 d脑含水量的检测结果*与正常对照组比较，P< 0.05 ;△与模型组比较，P< 0.05

　　2.2 超微结构观察 ( 见图1)

　　2.3 Western印迹方法测定AQP4蛋白(见图2)表2 Western印迹各组AQP4蛋白表达灰度值假手术组模型

　　3 讨 论

　　脑水肿是颅脑创伤(traumatic brain injury，TBI)致死和致残的主要因素之一。我们采用经典的Feeney[8]自由落体坠击伤大鼠模型，符合临床常见的加速型颅脑损伤，是研究创伤性脑水肿较理想的动物模型。本实验中，模型组与假手术组比较，各时间点的大鼠的脑组织的含水量均明显增加;且通过对其超微结构的观察，提示模型组中大鼠的微血管内皮不光滑，其周围的星型胶质细胞的足突明显肿胀，线粒体呈空泡状，嵴溶解，周围细胞器结构不清楚。证明本实验动物模型是成功的。

　　创伤性脑水肿的病理变化特点是过多的水分积聚在脑细胞内外间隙，脑体积增大，导致和加重颅内压增高，甚至引起脑移位和脑疝。创伤性脑水肿的发生是多因素参与的过程，属于混合性脑水肿。有研究表明在创伤早期，是以血管源性脑水肿为主要表现，随后出现细胞毒性脑水肿。近来研究显示，AQP4与脑水肿密切相关。AQP4是跨膜水转运通道蛋白家族中的一员，其广泛分布于脑内。其中，在毛细血管周围的由神经胶质细胞界膜组成的星型细胞足突上AQP4表达密度最高;其次，在室管膜细胞和室管膜下星型细胞中，以及下丘脑的视上核和视交叉上核中也有表达[9，10]。进一步研究显示，AQP4参与细胞毒性脑水肿的形成[11]，并有可能在血管源性脑水肿的消除中起作用[4]1291-1293。我们实验中发现，在创伤性大鼠模型组中，脑损伤后3 d，脑含水量达高峰，神经星形胶质细胞足突肿胀最明显。同时AQP4蛋白的表达在创伤后1 d的损伤周围皮层开始下降，到3 d AQP4的表达下降至最低，AQP4蛋白的减少在创伤早期血管源性脑水肿时不利于脑水肿的清除;在脑损伤后5 d脑含水量逐渐下降，同时AQP4表达又逐渐增高，提示在AQP4参与细胞毒性脑水肿的形成。因此，我们推测AQP4在创伤性脑水肿中的表达可能是时间依赖性的，可能与脑水肿的形成和消退有关。

　　大黄的主要功效为泻下攻积、清热泻火、止血、解毒，活血祛瘀，古代医家认为大黄是一味“一窍通诸窍皆通，大关通而百关皆通的要药，在1979年黄劳逸即指出大黄可使脑充血减退[12]。本实验研究大黄对创伤性脑水肿影响，大黄治疗组与模型组比较，各时间点的脑含水量均明显减少;且通过对其超微结构的观察发现大黄治疗组大鼠的星型胶质细胞的足突肿胀也明显减轻。由于AQP4与脑水肿发生关系密切，且在星型细胞足突上表达密度最高，因此我们对其做了进一步研究。结果显示，在脑创伤后1、3 d，大黄组中的AQP4的表达明显高于模型组，而第5、7 dAQP4表达明显低于模型组。因而，我们认为，在创伤早期以血管源性脑水肿为主时大黄能上调AQP4，对早期脑水肿的形成起保护作用;在创伤后期细胞毒性脑水肿出现后大黄又通过下调AQP4来减轻脑水肿的形成。因此，大黄可能通过减轻脑水肿来发挥保护脑组织的作用，其机制可能与控制AQP4的表达来实现的。这必将为治疗脑外伤提供新的途径。

　　【参考文献】

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　　[2] Amiry-Moghaddam M，Frydenlund DS.Ottersen OP Anchoring of aquaporin-4 in brain: molecular mech-anisms and implications for the physiology and pathophysiology of water transport[J]. Neuroscience，2004，129(4):999-1010.

　　[3] Amiry-Moghaddam M，Otsuka T，Hurn PD，et　al.An alpha-syntrophin-dependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(4):2106-2111.

　　[4] M C Papadopoulos，G T Manley，S Krishna，et al. Aquaporin-4 facilitates reabsorption of excess fluid in vasogenic brain edema [J]. FASEB J，2004，18(11):1291-1293.

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　　[6] 杨庭光，孙益平，符为民，等. 通脑灵合剂治疗急性中风的临床研究 [J].中国中医急症，1998 ，7 ( 3) :99.

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