纤维蛋白原Bβ455G/A、854G/A基因多态性与其含量及分子活性的相关性研究

　　作者：李静,许亚茹,元小冬　　作者单位：华北煤炭医学院附属开滦医院神经内科，唐山 063000

　　【摘要】目的探讨血浆纤维蛋白原(Fbg)Bβ455G/A、854G/A 基因型的分布特征及其基因多态性联合多种生理和环境因素对Fbg浓度和分子活性的影响。方法 采用整体抽样的方法选取开滦集团职工1 555人,样本均清晨空腹抽取静脉血测定血糖等12项生化指标;应用聚合酶链反应限制性酶切法进行两位点的基因多态性分析;采用微机辅助血浆Fbg功能自动监测系统测定血浆Fbg 浓度和Fbg 单体聚合反应速率(FMPV)、最大光密度(Amax)、FMPV/Amax等反映Fbg分子聚合功能参数;并进行体检和问卷调查。结果Bβ455等位基因 G、A频率分布为0.798、0.202，Bβ854等位基因G、A频率为0.899、0.101。两位点基因连锁不平衡分析为随机分布，两位点等位基因及基因型频率分布与性别无关(P>0.05);而高血压病组Bβ455等位基因G、野生基因型频率均高于无高血压病组(P<0.05) ;Bβ455各基因型组间Fbg浓度及分子活性指标均无差异性(P>0.05)，Bβ854GA+AA组Fbg浓度、FMPV/Amax、FMPV及Amax均明显高于GG组(P<0.01)。结论 Bβ455等位基因G和GG基因型与高血压病有关，但对Fbg浓度和分子活性无明显影响;Bβ854的变异基因型可以明显影响血浆Fbg浓度和分子聚集活性，但可以通过改变某些生理和环境因素增强或减弱其影响的程度。

　　【关键词】 纤维蛋白原,Bβ455G/A,Bβ854G/A,分子聚合功能

　　Abstract： Objective To investigate the genotype distribution of βFbg gene455G/A，854G/A, and gene Bβ455G/A，854G/A polymorphisms combined many physiological and environmental factors efecting on Fbg concentration and molecular reactivity.Methods 1 555 subjects from Tangshan coalminewere enrolled with study method of cluster sampling.The Bβ455G/A，854G/A polymorphisms were detected by polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism(PCRRFLP). Fbg concentration,fibin monome polymerized velocity(FMPV),absorbance maximum(Amax),FMPV/Amax and twelve biochemistry factors including glucose were measured.Face to face interviews were conducted to fill in questionnaires by trained interviewers.Results The frequencies of the G455,A455,G854,A854 allelewere 0.798,0.202, 0.899,0.101,respectively.The relationship between Bβ455G/A and Bβ854G/A was a random distribution. No different prevalence rates of Bβ455G/A and 854G/A were found on gender(P>0.05),but the distribution of G455 allele and GG genotype in the hypertension were higher than without the hypertension(P<0.05).No difference of Fbg concentration and molecular reactivity in Bβ455G/A genotypes was found(P>0.05),The level of Fbg,FMPV/Amax,FMPV and Amax in GA and AA combined genotyp was significantly higher than that in GG genotype of Bβ854 gene(P<0.01).Conclusion G455 allele andGG genotype of Bβ455 have related in hypertension,but there is no association between Bβ455 and Fbg concentration,molecular reactivity;Bβ854 genotypes have impact on Fbg concentration and molecular reactivity,further more,physiological and environmental factors might have coordinating functions.

　　Key words： Fibrinogen; Bβ455G/A; Bβ854G/A; Molecular reactivity

　　血浆纤维蛋白原(Fbg)是凝血系统中的核心成分，血浆Fbg浓度升高是缺血性脑血管病的重要危险因素，它可以促进动脉粥样硬化和局部血栓的形成。然而人体血浆Fbg浓度和分子功能受多种因素影响，如性别、年龄、雌激素、个人生活习惯(吸烟、运动)以及遗传因素等。研究表明，Fbg基因位于4q23～32大约50 kb的核苷酸序列上[1]，其中Bβ基因长度为8.2 kb，包括8个外显子与7个内含子，其中Bβ455G/A、854G/A位点定位于5′端启动子区，这两位点可以发生变异而表现多态性，即均可表现为GG、GA、AA 3种基因型。本项研究旨在分析Fbg Bβ455G/A、854G/A基因多态性及相关因素对于血浆Fbg浓度和分子活性的影响。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 应用整群抽样方法，于2002年7～9月对河北省开滦集团1 652名离退休职工进行体格检查，内容包括年龄、性别、体重指数、吸烟史、吸烟量、饮酒史、饮酒量、喝茶、喜辛辣食物、脑梗死病史、高血压病、糖尿病史、冠心病史、收缩期血压(SBP)、舒张期血压(DBP)，以及血糖(Glu)、血尿酸(UA)等80项指标。研究结束时资料完全者1 555人，其中男983例、女572 例，年龄65.10±7.15岁。本资料的失访率为5.87%，失访主要原因为结果不完整。所有样本已除外有明确肿瘤和其它明显脑动脉栓子来源的患者。

　　1.2 实验方法 所有样本均抽取清晨空腹静脉血8～10 ml，取其中3 ml加2%EDTA抗凝，低渗法分离白细胞，采用饱和酚氯仿抽提方法提取人基因组DNA;再取3 ml血样提取血清测定相关生化指标;将剩余血标本用枸橼酸钠抗凝，提取血浆测定Fbg浓度及反映分子活性的指标。

　　1.2.1 基因多态性分析PCR扩增目的DNA

　　Bβ455 上游引物：5′ATAGAATAGGGTATGAATTTG3′，

　　下游引物：5′GGCTGAACCATTTTATCATTT3′;

　　Bβ854上游引物：5'CTGGGATTTGGATTACTGACTGGT3′，

　　下游引物：5'TGAGGCCCATTTTCCTTGAATT3′，

　　分别用限制性内切酶Hae Ⅲ、EcoRⅠ及相应缓冲液37℃水浴消化过夜。酶切产物于2.5%琼脂糖凝胶上电泳后，在紫外灯下观察结果，Bβ455 位点AA型酶切产生一个446片段，GG型酶切产生348 bp、98 bp两个片段，GA型酶切产生446 bp、348 bp、98 bp三个片段;Bβ854位点AA型酶切仅见133 bp一个片段，GG型酶切可见111 bp、22 bp两个片段，GA型酶切可见133 bp、111 bp、22 bp三个片段。

　　1.2.2 血液生化指标的测定 应用全自动生化仪(日产7060Automatic Analyzer)测定血Glu、UA、肌苷(CR)、尿素氮(BUN)、极低密度脂蛋白(VLDL)、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL)、谷丙转氨酶(ALT)等生化指标。

　　1.2.3 Fbg浓度及分子活性系列指标的测定 采用微机辅助血浆Fbg功能自动监测系统测定Fbg浓度、纤维蛋白单体聚合反应速率(FMPV)、最大光密度(Amax)和FMPV/Amax。具体方法参见文献[2]。

　　1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。基因计数法计算等位基因频率，遗传学χ2检验方法进行基因型的HardyWeinberg平衡吻合度检验，基因位点间的遗传连锁不平衡关系采用Kappa一致性检验，并进行多元逐步回归分析及Logistic多因素回归分析。

　　2 结 果

　　2.1 FgBβ455G/A、854G/A等位基因和基因型的分布(表1) Bβ455和854位点均为G和A等位基因，其频率分布符合HardyWeinberg平衡定律(Bβ455：χ2=1.60，P>0.05;Bβ854：χ2=0.42，P>0.05);Bβ455、854位点的基因多态性均表现为GG、GA、AA三种基因型，其基因遗传连锁不平衡分析显示两者吻合度较弱(Kappa=0.025， 0≤k<0.4)，两位点等位基因分布为随机组合，呈完全非连锁不平衡。因这两个位点的GA、AA基因型分布频率较低，故将两者合并为GA+AA组进行分析。表1 Bβ455G/A、854G/A基因型及等位基因分布

　　2.2 Bβ455、854各基因型组Fbg系列指标测定结果(表2) Bβ455各基因型组间Fbg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax的差异均无显著性(P>0.05)。Bβ854的GA+AA组Fbg 浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均明显高于GG组(P<0.01)。表2 Bβ455、854各基因型的Fbg系列指标测定值

　　2.3 多因素分析结果 以Fbg浓度为因变量进行多元逐步回归分析，依次筛选出Bβ854基因型、SBP、喝茶等3个相关因素，其标准回归系数(β)分别为0.286、0.062、0.059，P<0.05;以FMPV为因变量，依次选出Bβ854基因型、SBP、喝茶，β分别为0.255、0.075、0.063，P<0.05;以Amax为因变量，依次选出Bβ854基因型、喜辛辣食物，β分别为0.093、0.062，P<0.05;以FMPV/Amax为因变量，依次选出Bβ854基因型、身高、脑梗死病史、年龄，β分别为0.126、0.083、0.057、0.052，P<0.05。以Bβ455基因型为因变量，则依次选出高血压病、SBP，β分别为0.078、0.059，P<0.05;以Bβ854基因型为因变量，依次选出Fbg浓度、DBP、CHO、年龄，β分别为0.288、0.061、0.053、0.052，P<0.05。

　　以有无脑梗死病史为因变量进行多因素Logistic回归分析，则筛选出高血压病、体重指数、辛辣、性别、吸烟史、Glu、饮酒史、冠心病史、年龄、SBP等10个变量。见表3。表3 脑梗死病史影响因素的Logistic回归分析

　　2.4 主要影响因素的分层分析结果 按性别、年龄(<60岁和≥60岁)、是否喝茶、有无高血压病、有无脑梗死病史进行分层分析，仅在按高血压病分层时高血压病组Bβ455G等位基因和GG基因型频率高于无高血压病组(χ2=6.426，P=0.011;χ2=4.376，P=0.036)，而其它状态Bβ455、854两位点等位基因和基因型频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)。按上述因素分层后进行组内比较，Bβ455的 GA+AA组与GG组Fbg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均无差异性(P>0.05);但Bβ854按性别分层后进行组内比较男性和女性GA+AA组的Fbg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均明显高于GG组(P<0.01);在<60岁组内GA+AA组的Fbg浓度、FMPV、Amax均明显高于GG组(P<0.01)，FMPV/Amax也高于GG组(P<0.05)，≥60岁组中GA+AA组的Fbg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均明显高于GG组(P<0.01);喝茶、不喝茶、高血压病、无高血压病组中GA+AA组均高于GG组(P<0.05);在无脑梗死病史组内GA+AA组的Fbg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均明显高于GG组(P<0.01);而有脑梗死病史组内GA+AA组的Fbg浓度、FMPV、Amax均明显高于GG组(P<0.01)，FMPV/Amax在GA+AA组与GG组无差异性(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　本研究结果显示，Bβ455、854等位基因频率的分布符合HardyWeinberg平衡，说明本研究的样本具有群体代表性。Bβ455等位基因G和A的分布频率分别为0.798、0.202，与其他地区的汉族和不同国家非汉族人群调查的结果有明显的差异[35]，说明此位点的基因多态性可能受种族和环境的影响[6];Bβ854等位基因G、A的分布频率为0.899、0.101，而其他国家和地区人群关于Bβ854频率的报道较少，故其与种族和环境的关系需进一步研究。同一条染色体不同基因位点的等位基因在向子代遗传时，即可以完全随机自由组合，也可相互连锁形成连锁不平衡的表象。本研究表明，此两位点等位基因分布为随机组合，呈完全非连锁不平衡，但其有较稀少的Bβ854的A等位基因与Bβ455出现频率高的G等位基因常出现在同一个体的趋势，这与其它的报道一致[7]。

　　近年研究表明，同时测定血浆Fbg浓度和Fbg分子聚合功能可较全面地反映Fbg的真实功能活性状态[8]，而FMPV反映了血浆Fbg总的聚集功能状态，Amax表示纤维蛋白单体的最大聚合率，FMPV/Amax则代表纤维蛋白分子本身的聚合活性，且不受血中Fbg浓度高低的影响，此值升高表示Fbg反应性增强[9]。有研究通过邻近启动子结构的转染技术证实，Bβ854的A等位基因可独立增强BβFbg基因的基础转录率，且A等位基因在健康中年男性中亦与Fbg浓度显著相关[7]。在本研究中，Bβ854 变异基因型的Fbg浓度、FMPV、FMPV/Amax、Amax均明显高于野生基因型，不但证实了Bβ854的变异基因型可以引起Fbg浓度改变，而且可能导致其分子聚合功能变化。以Bβ854基因型为变量，则依次选出Fbg浓度、DBP、CHO、年龄，说明Bβ854变异基因型在影响Fbg浓度的同时还可进一步影响到DBP、血CHO等生理因素，且随年龄增大这种变化更加明显;以Fbg浓度为因变量进行多元逐步回归分析的结果也表明Bβ854基因型是其重要的影响因素，且进而引起SBP升高，但喝茶可以削弱这种作用，提示喝茶是一种保护性因素，其原因尚需进一步研究。同样，以FMPV、Amax、FMPV/Amax为因变量，也均首先筛选出Bβ854基因型，且后者还依次筛选出身高、脑梗死病史、年龄，则进一步证实Bβ854基因型是Fbg浓度和分子功能最重要的影响因素，并在引起分子聚合功能改变的基础上与脑梗死的发病有关，且随年龄增大这种影响更加明显，并可以通过特定生理和环境因素来进一步增强或减弱其影响的程度，从而降低脑梗死疾病发病的危险性，说明脑梗死疾病是遗传和环境因素互相作用的结果。

　　本研究未发现Bβ455各基因型组间Fbg系列指标有差异，提示此位点对Fbg浓度和分子聚合功能没有直接影响，但以Bβ455基因型为因变量，筛选出了高血压病和SBP，说明此位点与高血压病的发病有关。

　　当以既往有无脑梗死病史为因变量进行多因素Logistic回归分析时，没有发现这两个位点的基因型，特别是Bβ854基因型与其有关系，与其它报道相同[10]，这与本研究人群中的脑梗死人群均为既往陈旧性梗死，并非急性期患者，且此组患者坚持服用阿司匹林药物的比率很高，因此没有急性脑梗死患者的明显Fbg分子聚合功能改变有关。 这也进一步证实了Bβ854基因型是在改变了Fbg浓度和分子聚合功能以后才成为脑梗死的易感因素。同时，筛选出的高血压病、体重指数、吸烟史、Glu、冠心病史、年龄、SBP等危险因素和女性、饮酒史等保护因素，通过控制和消除危险因素和增加保护性因素，可降低脑梗死的发病率。

　　同样，本研究按性别、年龄(<60岁和≥60岁)、喝茶、高血压病、脑梗死病史进行分层分析，发现Bβ455的G等位基因和GG野生基因型分布频率与高血压病有相关性，提示它可能是高血压病的易感基因之一;而Bβ455、854两位点等位基因和基因型的频率分布与性别、年龄、喝茶、脑梗死病史等因素没有明显的关系。另外，Fbg浓度和分子活性不受Bβ455的等位基因和基因型的影响，但Bβ854按上述因素分层后进行组内比较，变异基因型人群的Fbg浓度、FMPV、Amax及FMPV/Amax均高于野生基因型人群，仅在有脑梗死病史组内野生基因型人群与变异基因型的FMPV/Amax无差异性，提示在脑梗死恢复期Fbg反应性没有增强，这可能与本组人群正在服用阿斯匹林进行二级预防的比率很高有关系。

　　综上所述，Bβ455和854两位点基因等位基因遗传连锁不平衡分析显示为随机组合，呈完全非连锁不平衡。Bβ455的基因多态性与高血压病有关，其等位基因和基因型对于Fbg浓度和分子活性无明显影响。Bβ854的变异基因型可以明显影响血浆Fbg浓度和分子聚合活性，与脑梗死的发病有关。并均与环境因素互相作用。

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