创伤弧菌溶血素基因的高效表达与鉴定

　　作者：魏杰　　作者单位：兰州大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，甘肃 兰州

　　【摘要】 目的：构建创伤弧菌溶血素基因(vvc)的融合表达载体，并实现创伤弧菌溶血素在大肠杆菌中的高效表达. 方法: 用一对创伤弧菌溶血素基因特异性引物从创伤弧菌基因组DNA 中钓取vvc基因，TA克隆后测定核苷酸序列，构建pET32a(+)- vvc融合表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG 诱导表达,表达产物行SDSPAGE并进行Western Blot 鉴定. 结果: 构建了pET32a(+) vvc融合表达载体，DNA 测序证明,获得的vvc基因长度为1311 bp,与GenBank 中报道的创伤弧菌溶血素基因序列完全一致. SDSPAGE 分析表明, vvc融合蛋白Mr 为71×103,其表达量约占菌体总蛋白的32%. Western blot 结果显示，目的蛋白可与创伤弧菌免疫后的小鼠血清特异性结合. 结论： 成功地实现了VVC基因在大肠杆菌中的高效表达，为进一步研究vvc蛋白的生物学功能奠定基础.

　　【关键词】 弧菌,创伤,溶血素类,基因表达

　　0引言

　　创伤弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)自然存在于近海和海湾的海水和海底沉积物中[1]，人体感染后病情发展迅速，最终发展为感染性休克、多器官衰竭而死亡，死亡率高达70%[2]. 创伤弧菌溶血素(Vibrio vulnificus cytolysin，vvc)的活性高达81 000 溶细胞单位(HU/mg)，给实验小鼠尾静脉注射毫克级以下水平的vvc就可以引发死亡[3]. 体外实验研究表明，vvc对肥大细胞[4]、红细胞[5]等哺乳动物的细胞都可以产生显著的细胞毒性作用，但其确切的致病机制还不十分清楚. 本研究构建了pET32a(+) vvc原核表达系统,采用创伤弧菌全菌抗体对融合蛋白进行鉴定,为今后创伤弧菌快速诊断试剂盒的制备及vvc基因表达调控机理和功能研究奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1菌种、载体与实验动物创伤弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌为海军总医院检验科实验室保存菌种;大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、原核表达载体 pET32a(+)以及BALB/c小鼠均来自本实验室.

　　1.1.2工具酶与主要试剂PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、溶菌酶 Lysozyme 、DNA和蛋白质Marker均为北京天根试剂公司产品;限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶和pGEMT Easy 购于 Promega公司.

　　1.2方法

　　1.2.1细菌活化将创伤弧菌菌株按1∶100接种于预先预热至37℃的LB 培养基中，37℃ 220 r/min振摇培养6 h，以待备用.

　　1.2.2模板制备取1.5 mL活化菌液于13 000 g离心2 min，彻底倒尽上清液，用双蒸水洗涤一次，13 000 g 离心2 min，去上清，将菌体悬浮，盖上盖子，在沸水中煮5 min，13 000 g离心5 min，将上清储存在-20℃，取2～4 μL进行PCR.

　　1.2.3引物设计根据GenBank 公布的创伤弧菌VVC基因核苷酸序列和内切酶图谱分析结果自行设计含有合适内切酶位点的特异性引物. vvc引物序列：上游5′CGCGGATCCCAAGAATATGTGCCGATTGTT3′(BamHⅠ)，下游5′CCCAAGCTTGAGTTTGACCTGTTGTAATGT3′(Hind Ⅲ),送上海生工生物公司合成.

　　1.2.4PCR反应PCR反应总体积为25 μL，引物浓度为10 μmol/L，50 ng DNA 模板. PCR反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s;58℃复性45 s;72℃延伸1 min共30个循环;72℃继续延伸10 min. 待反应结束后，取5 μL扩增产物于10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物.

　　1.2.5vvc基因的纯化与回收按照DNA胶回收试剂盒操作说明，从琼脂糖电泳中将目的条带切下，用胶回收试剂盒回收纯化PCR 产物.

　　1.2.6TA克隆、测序与表达载体的构建应用TA 克隆试剂盒，将扩增的目的片断克隆至pGEMT 载体，转化于E. coli DH 5 α感受态细胞中37℃过夜培养，在平板上挑取单个菌落，进行PCR鉴定，获得满意测序结果后，通过质粒提取试剂盒小量制备质粒pGEMTvvc和pET32a(+)，利用BamHⅠ和HindⅢ分别进行双酶切，回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下将vvc基因酶切片段与pET32a(+)酶切产物16℃ 连接过夜, 构建重组质粒pET32a(+)vvc，连接后转化于E. coli BL21(DE3),扩增、提取质粒进行双酶切后再次测序，测序结果用NCBI 中的Blast 软件分析.

　　1.2.7重组质粒pET32a(+)vvc 在大肠杆菌中的诱导表达挑取经酶切鉴定的原核表达质粒pET32a(+)vvc 单菌落，培养至A600 nm=0.5 时，加入1 mmol/L IPTG 37℃诱导表达6 h，菌液离心，收集菌体，用PBS 重悬并加入溶菌酶(1g/L), 于-70℃反复冻融以裂解菌体，离心收集上清和菌体沉渣，分别取10 μL进行SDS PAGE，考马斯亮蓝R250 染色，甲醇冰醋酸脱色液脱色，观察蛋白的表达产量和分子量.

　　1.2.8小鼠抗全菌血清的制备取6~8 wk龄、体质量20 g左右的BALB/c 雌性小鼠24只，随机分为4 组，除对照组外，其余3组分别用创伤弧菌、溶藻弧菌和副溶血性弧菌免疫. 初次免疫用弗氏完全佐剂，于腹股沟注射.3 wk加强免疫，抗原量同首次，加弗氏不完全佐剂，以后每隔2 wk加强免疫1 次，共免疫4 次. 最后1 次免疫后7 d，摘眼球取血，将分离的血清冻存于-20℃中.

　　1.2.9Western Blot 分析首先制备电泳凝胶，将备好的样品沉淀各10 μL加入到4个孔内，进行SDSPAGE电泳，结束后将这4个孔对应的凝胶整齐切割、分开，依次转移到膜上,再分别与4组实验动物的血清中的一种作为一抗，都将HRP 标记的兔抗鼠IgG作为二抗，DAB显色进行重组蛋白的免疫印迹检测.

　　2结果

　　2.1PCR 产物经PCR 扩增出约1311 bp的特异性基因片段, 大小同预计结果相符.

　　2.2pET32a(+)vvc重组质粒的酶切鉴定将重组质粒用限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后, 经琼脂糖凝胶电泳结果显示有约5900 bp左右和约1311 bp左右的的2个DNA 片段出现，均符合预期的结果.

　　2.3酶切vvc片断的序列测定除去引物序列,测得vvc基因的序列长度为1311 bp，编码437 个核苷酸，与GenBank 中已报道的序列进行同源性比较，结果完全一致.

　　2.4重组质粒pET32a(+)vvc在大肠杆菌中的诱导表达SDSPAGE 分析后，沉淀中明显有融合蛋白的特异条带，上清中无特异条带，表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中. 灰度扫描软件分析显示，BL21(DE3)菌株融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的32%.

　　2.5VVC蛋白的Western Blot分析发现含有重组质粒pET32a(+)vvc 的BL21(DE3)的诱导表达产物，只与鼠抗Vv血清发生结合，并在Mr为71×103 处可见明显的杂交信号，表明鼠抗Vv抗体能与目的融合蛋白发生特异性结合.

　　1：融合表达蛋白与创伤弧菌抗体血清的反应;2：融合蛋白与对照血清的反应;3：融合蛋白与溶藻弧菌抗体血清的反应;4：融合蛋白与副溶血性弧菌抗体血清的反应.

　　3讨论

　　人一旦感染了创伤弧菌溶血素(vvc), 短时间内就会引起伤口炎症，严重时就会导致败血症的发生. Kwon等[6]通过研究vvc对内皮细胞凋亡的诱导可能是创伤弧菌败血症的重要的病理生理机制. Kang等[7]研究发现vvc能够使感染的小鼠在发展到败血症的情况下，产生大量的NO，从而导致宿主发生败血症性休克. 为进一步深入研究vvc确切的致病机制. 本研究构建了原核表达载体pET32a(+)vvc，经SDSPAGE 显示，在Mr 71×103 处有明显的特异蛋白条带. 该蛋白是由载体自身T7 Lac启动子下游的硫氧还蛋白组氨酸(TrxHis)标签基因所编码的TrxHis 蛋白和vvc基因所编码的融合蛋白组成. TrxHis 蛋白大小约为20.4 ku, vvc基因则紧接在载体自身的TrxHis 标签基因之后, vvc基因编码的融合蛋白大小约50851[9],因此,经载体T7 启动子表达的产物为71×103左右的融合蛋白. 分析产生包涵体的原因可能是VVC外源蛋白在大肠杆菌中过量表达和所表达的蛋白长度大于100 个氨基酸残基. 包涵体的形成一方面使目的蛋白相对集中、稳定，通过离心就能相对容易地纯化;另一方面强变性剂对进一步纯化有时可能带来困难,须灵活掌握提纯条件.

　　总之，本研究成功地构建了pET32a(+)vvc重组质粒, 并在大肠杆菌中实现了高效表达，为进一步了解VVC蛋白的生物学活性和阐明该菌的致病机制打下基础.

　　【参考文献】

　　[1]Pfeffer CS,Hite MF,Oliver JD. Ecology of Vibrio vulnificus in estuarine waters of eastern North Carolina[J]. Appl Environ Microbiol,2003,68:3526-3531.

　　[2]郭建巍,马骢. 创伤弧菌实验室诊断的研究进展[J]. 中华检验医学杂志,2006,29(9):851-853.

　　[3]Park JW,Ma SN,Song ES,et al. Pulmonary damage by Vibrio vulnificus cytolysin[J]. Infec Im mun,1996,64:2873-2876.

　　[4]Yamanaka H,Sugiyama K,Furuta H,et al. Cytolytic action of Vibrio vulnificus hemolysin on mast cells from rat peritoneal cavity[J]. Med Microbiol,1990,32:39-43.

　　[5]Chae MR,Kim HN,Park KH,et al. Speciesspecific hemolysis by Vibrio vulnificus cytolysin[J]. Exp Mol Med,1996,28:95-99.

　　[6]Kwon KB,Yang JY,Ryu DG,et al. Vibrio valnificus cytolysin induces supemxide anion•initia ted apoptotic signaling pathway in human ECV304 cells[J]. Biol Chem,2001,276(50):47518-47523.