实验性重症急性胰腺炎继发肺损伤时基质金属蛋白酶-9的变化

　　作者：张彦荣,毕伟,李锰,王志波,张民英　　作者单位：050000 石家庄市，河北医科大学第二医院外科

　　【摘要】目的通过观察实验性重症急性胰腺炎继发肺损伤时基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的变化，探讨MMP-9对实验性重症急性胰腺炎(SAP)继发肺损伤的影响。方法 SD大鼠24只随机分成2组，对照组与SAP组各12只。采用5%牛磺胆酸钠多点位胰腺被膜下注射建立重症胰腺炎模型。SAP组制模后12 h取材，检测各组肺湿重系数、血清淀粉酶量、支气管细胞灌洗液细胞数及蛋白量、肺、胰腺组织形态学改变及MMP-9表达情况等指标。结果 SAP组上述各项指标均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，SAP组肺组织内MMP-9阳性呈高表达。结论 在SAP发病中因炎性细胞、致炎因子的激活而大量释放MMP-9，这与SAP合并肺损伤有密切关系。

　　【关键词】 重症急性胰腺炎,并发症,肺损伤;基质金属蛋白酶-9;肺湿重系数

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) on severe acute pancreatitis(SAP) complicated with lung injury.Methods SAP was induced in SD rats by injecting 5% sodium taurocholate(0.15 ml/100 g) under pancreatic capsule.The SD rats were randomly divided into two groups: control group (n=12) and SAP group(n=12). The wet weigh index of lung, serum amylase level, the number of cells, quantity of protein in bronchoalveolar lavage fluid and MMP-9 levels in lung were detected at 12 hours after SAP models were set up.Results The wet weigh index of lung, serum amylase level, the number of cells, quantity of protein and the levels of MMP-9 in lung were all increased in rats of SAP group, as compared with those of control group (P<0.05).Conclusion MMP-9 is released greatly in SAP,which is closely related with SAP complicated with lung injury.

　　【Key words】 severe acute pancreatitis; complication;lung injury; matrix metalloproteinase-9;wet weigh index of lung

　　基质金属蛋白酶-9(MMP-9)是金属蛋白酶家族中分子量最大的酶，又称为明胶酶B。MMP-9主要由中性粒细胞和巨噬细胞分泌，参与降解破坏细胞外基质中的最主要组成成分IV、V胶原和明胶。在正常情况下，MMP-9在肺组织内表达较少，当炎性细胞被激活，致炎因子大量释放，可促进MMP-9的高表达[1]。近年来，MMP-9在重症急性胰腺炎(SAP组)中的作用被广泛关注，本研究旨在探讨MMP-9与SAP继发肺损伤的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物分组 成年SD大鼠24只，体重(300±10)g(由河北医科大学动物实验中心提供)。随机分为2组：SAP并肺损伤组(SAP组)12只;对照组即假手术组12只，除不注射牛磺胆酸钠液外，余操作与实验组相同。

　　1.2 实验动物模型的制备[2] 术前12 h禁食，自由饮水，以1%戊巴比妥钠(0.3 mg/100 g)腹腔注射麻醉，取上腹正中切口入腹，显露胰腺，于胰尾被膜下穿刺，向胰管开口方向缓慢注入牛磺胆酸钠液(0.15 ml/100 g)，使整个胰腺均匀隆起，并采用背部皮下注射法补液(生理盐水5 ml)。动物制模后12 h处死取材。

　　1.3 观察指标 (1)肺湿重系数：湿重/干重×100%;(2)血清淀粉酶：成模后12 h经大鼠心脏穿刺取血，离心，全自动生化分析仪检测;(3)支气管肺泡灌洗液中的细胞数及蛋白量：处死动物前经气管插管入支气管注入生理盐水5 ml，反复5次，回收液体，用血球计数板涂片细胞计数;将回收液以1 500 r/min离心10 min，取上清液进行蛋白测定;(4)肺、胰腺组织学检查：成模后12 h处死动物，取肺脏组织及胰腺组织HE染色，光镜观察;(5)肺组织MMP-9的检测：采用免疫组织化学SP法，试剂为鼠抗人单克隆抗体，由武汉博士德公司提供。MMP-9阳性标准：细胞浆出现棕黄色或核内有棕黄色颗粒。随即观察5个高倍视野：阴性(-)无着色细胞，阳性(+)1个视野可见稀疏颗粒，中等强度阳性(++)2～4个视野可见颗粒，强阳性(+++)可见弥漫性棕黄色颗粒。

　　1.4 统计学分析 所测数据采用SPSS 11.5统计软件处理，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验，等级资料采用非参数统计的秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　图1 SAP组大鼠胰腺组织胰腺腺泡肿胀并可见组织坏死，组织结构消失间质内大量红细胞及成堆的中性粒细胞浸润(HE染色10×20)(略)

　　图2 SAP组大鼠肺组织可见肺泡间隔水肿增宽，红细胞渗出，大量中性粒细胞浸润，肺毛细血管充血破裂，肺组织结构破坏(HE染色10×20)(略)

　　图3 SAP组大鼠肺组织免疫组化，可见炎性细胞、肺泡间质细胞胞浆及基底膜着色(SP法10×20)(略)

　　2 结果

　　2.1 胰腺组织和肺组织学检查 (1)胰腺组织光镜观察：SAP组胰腺腺泡肿胀并可见大片组织坏死，组织结构消失间质内大量红细胞及成堆的中性粒细胞浸润，见图1;对照组无明显变化。(2)肺组织光镜观察：SAP组可见肺泡间隔水肿增宽，红细胞渗出，大量中性粒细胞浸润，肺毛细血管充血破裂甚至部分出现实变，肺组织结构破坏，见图2。对照组仅见少量中性粒细胞浸润。(3)肺组织免疫组化光镜观察：SAP组肺泡间质细胞、炎性细胞胞浆及基底膜可见着色，见图3。

　　2.2 测定指标观察 2组大鼠各项指标比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。肺组织MMP-9的表达率比较，其差异具有统计学意义(P<0.01)，见表2。

　　表1 2组大鼠血清淀粉酶含量，支气管肺泡灌洗液细胞数、蛋白量，肺湿重/干重比的比较(略)

　　注：与对照组比较，*P<0.01

　　表2 2组大鼠肺组织MMP-9的表达(略)

　　注：与对照组比较，*P<0.01

　　3 讨论

　　SAP继发肺损伤率高达60%～70%，其中20%可发展致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，成为SAP的主要致死原因之一[3]。本实验显示：SAP继发肺损伤时MMP-9在肺内高表达，与对照组比较其差异有统计学意义(P<0.01)，说明MMP-9与SAP继发肺损伤病情严重程度正相关，而且血淀粉酶量、支气管肺泡灌洗液细胞数与蛋白量、肺湿重/干重比亦反映SAP及继发肺损伤程度，指标在2组间与MMP-9的表达相一致。同时组织学观察亦说明SAP继发肺损伤与对照组有明显差异。在通常情况下，MMP-9的活性被控制在较低水平，主要参与机体生理活动，在异常时才会出现MMP-9的高表达，普遍认为MMP-9参与了炎性细胞分化过程及炎性细胞的迁移及组织浸润过程[4]，同时认为肿瘤坏死因子-α，白介素-1及上皮细胞生长因子趋化并促进中性粒细胞释放MMP-9[5]。Muhs等[6]应用MMP-9抑制剂可降低中性粒细胞在肺内聚集和MMP-9的表达。众所周知，SAP发病不仅局限于胰腺本身，它是全身性炎症反应，可导致多器官功能衰竭。肺损伤发生率最高，其机制在于MMP-9作为主要的基质分解酶，分解肺泡细胞基质，破坏了肺气血屏障，Tobles等[7]通过western blots检测肺组织中MMP-9含量，发现正常肺组织内无MMP-9表达，而在SAP中却是高水平表达，这与本实验情况相近。因此，SAP发生后大量炎症因子释放，作用于中性粒细胞和巨噬细胞，大量释放MMP-9，作用于肺毛细血管，并破坏基底膜，使肺细胞通透性增高，导致肺结构的破坏。

　　【参考文献】

　　1 黄海.肿瘤基质金属蛋白酶低表达及其抑制剂的研究进展.河北医药，2003，25：618-619.

　　2 汪谦主编.现代医学实验方法.第1版.北京：人民卫生出版社，1997.1084.

　　3 马俊义.急性呼吸窘迫综合征诊断新进展.河北医药，2002，24：361-363.

　　4 Bisaro de Lorenc L，Ramos AM，Sanchez MC，et al.Structural evaluation of plasma alpha2-macroglobulin in acute pancreatitis.Clin Chem Lab Med，2005，43：1183-1189.

　　5 Trumale H，Nakanishi I，Yamashitak，et al.Matrix metalloproteinase-9 from u937 monoblastoial correlation with cellular invasion. J Cell Sci，1993，104：9913.

　　6 Muhs BE，Patel S，Yee H， et al. Inhibition of matrix metalloproteinases reduces local and distant organ injury following experimental acute pancreatitis.Surg Res， 2003，109：110-117.

　　7 Tobles Keek， James H， Balcomzv M. Matrix metalloproteinase-9 promotes neutropnil migration and alveolar capillary leakage in pancreatitis-associated lung injury in the rat.Gastroenterology，2002，122：188-201.