脑缺血大鼠水通道蛋白9 mRNA表达与钙离子浓度的改变及其关系

　　作者：李燕华,李瑶宣,李吕力,王铁建　　作者单位：南宁，广西壮族自治区人民医院神经内科

　　【摘要】目的 研究脑缺血后脑组织水通道蛋白9(AQP9)mRNA表达和Ca2+浓度的改变及其关系。方法 制作脑缺血大鼠模型，在脑缺血6 h、1 d、2 d、3 d、5 d，用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测缺血脑组织AQP9 mRNA的表达水平;用Fura2/AM荧光法测定水肿区脑细胞内Ca2+浓度;并与对照组比较。结果 与对照组相比，脑缺血后6 h，水肿区脑组织AQP9 mRNA表达水平和Ca2+浓度均开始增高，在脑缺血后第2 d、3 d表达最强(P<0.05～0.01);AQP9 mRNA表达水平与Ca2+浓度呈正相关(r=0.7654,P<0.05)。结论 脑缺血后AQP9表达增强，Ca2+浓度增高;提示AQP9和Ca2+可能共同参与缺血性脑水肿的形成。

　　【关键词】 脑缺血,脑水肿,水通道蛋白,9 钙离子

　　Abstract：Objective To investigate the changes and their relationship of aquaporin9(AQP9) mRNA expression and Ca2+ concentration of brain tissue after cerebral ischemic.Methods The models of cerebral ischemic in the rats were made by occluding unilateral middle cerebral artery with the suture method. The expression level of AQP9 mRNA was assessed by RTPCR at interval times of 6 h,1 d,2 d,3 d,5 d after cerebral ischemic, respectively. Fura2/AM fluoremetry technique was used to determine the cellular Ca2+ concentration of brain tissue. The results were compared with control group. Results Compared with control group, the expression level of AQP9 mRNA and the concentrations of Ca2+ significantly increased at 6 h in ischemic edema tissue, and reached a peak at 2 d,3 d after cerebral ischemic(P<0.05～0.01). There was a positive correlation between expressions level of AQP9 mRNA and concentration of Ca2+ after cerebral ischemic(r=0.7654,P<0.05). Conclusions Both the expression of AQP9 mRNA and concentration of Ca2+ in ischemic tissue increase after cerebral ischemic, which indicates that the AQP9 and Ca2+ may be significantly correlated with the ischemic edema formation.

　　Key words：cerebral ischemic; brain edema; aquaporin9; Ca2+

　　脑缺血后脑水肿的产生机制目前尚未阐明。现普遍认为,细胞内钙超载是各种因素所致神经细胞死亡的最后共同通路。近年来，水通道蛋白9(AQP9)作为介导水转运的重要因子，已证实在脑组织的水调节代谢中起关键作用[1,2]。然而，有关脑缺血后 AQP9的表达与 Ca2+之间的关系目前尚未见报道。本实验通过制作脑缺血大鼠模型，观察水肿区脑组织AQP9 mRNA的表达和Ca2+浓度的变化及其关系，以探讨AQP9和Ca2+在缺血性脑水肿中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，质量250 ～ 300 g，随机分为对照组和脑缺血组，后者又分为缺血后6 h、1 d、2 d、3 d、5 d组;每组10只。AQP9 mRNA测定所用的Trizol试剂、MMLV逆转录试剂盒和AQP9引物均为上海生工产品，Ca2+测定的Fura2/AM为美国Sigma公司产品。其余化学试剂为国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 脑缺血大鼠模型的制作[3] 脑缺血组大鼠禁食12 h、禁水6 h后，3.5 %水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈总和颈外动脉，在颈总动脉近分叉处剪一“V”形切口，将直径为0.26 mm的鱼线经切口插入颈内动脉约18 ～ 20 mm (根据动物大小适当调整插入的深度)，阻塞右侧大脑中动脉，固定外端的鱼线，缝合皮肤，腹腔注射青霉素预防感染。大鼠清醒后回笼自由进食。术后观察大鼠的神经症状和体征，根据Zea longa 评分标准进行脑缺血模型成功的评判。对照组：除不插鱼线外，其余操作与脑缺血组相同。

　　1.2.2 AQP9 mRNA表达水平测定 分别将对照组和脑缺血后各时间组5只大鼠处死，取水肿区脑组织用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)分析AQP9 mRNA表达水平。用Trizol试剂按说明书介绍的方法提取组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量，分装后-80℃保存备用;采用MMLV逆转录试剂盒，按操作说明将组织总RNA中的mRNA逆转录成cDNA;依照AQP9 cDNA序列，参考Yamamoto等[4]方法，设计合成引物两对，AQP9引物上游序列为：5′GATGCCTTCTGAGAAGGACA3′,下游序列为：5′CGATGCTCTTGGTATTGGCT 3′,扩增片段长218 bp;βactin引物上游序列为：5′ACCTCCAACACCCCAGCCATG3′，下游序列：5′CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG3′，扩增片段长698 bp。扩增条件：94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环35次后，72℃延伸7 min。PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测，长波紫外灯下观测并照相，电泳结果用Quantity One(BicRad公司)分析系统进行电泳条带光密度分析，计算AQP9产物与βactin产物的光密度积分的比值，作为AQP9 mRNA表达的水平。

　　1.2.3 脑细胞内Ca2+浓度的测定 分别将对照组和脑缺血后各时间组5只大鼠处死，参考Grynkiewicz等[5]的方法，取水肿区脑组织，用0.25 %胰蛋白酶消化及机械吹打制备脑细胞悬液，台盼兰排斥试验检查，细胞存活率在90%以上，将细胞数调整到2×106/ml，然后用DMEM(含10 %小牛血清)配制成细胞悬液，分样品管和对照管，样品管用0.5 mmol/L Fura2/AM溶液(终浓度为5 μmol/L)负载，对照管加等量的二甲基亚矾(DMSO)，并分别在37℃恒温摇床振荡孵育40 min，用DHank液洗涤2次，调整细胞浓度为2×106/ml，荧光测定采用Shimadzu RF540荧光分光光度计，发射光波长为510 nm，激发光波长为340 nm，分别测定不同时间段细胞悬液的荧光强度，根据公式[Ca2+]i=Kd×[(F-Fmin)/(Fmax-F)]，计算细胞内游离Ca2+浓度。公式中Kd为Fura2/AM的解离常数，Kd=224 nmol/L，F为340 nm激发波长测得的荧光强度，Fmax是在F值测定后加入TritonX100(终浓度为0.1%)后的最大荧光强度，Fmin是在Fmax基础上加入EGTA(终浓度为5 mmol/L)后测得的最小荧光强度值。式中F、Fmax、Fmin均为样品管与对照管荧光值之差。

　　1.2.4 统计学方法 检测结果以均数±标准差(±s)表示，用SPSS 10.0软件分别进行t检验和相关分析。

　　2 结果

　　2.1 脑缺血组与对照组大鼠脑组织AQP9 mRNA表达水平比较 见表1。脑缺血各时间点组脑组织AQP9 mRNA表达水平均增高;脑缺血后6 h，水肿区AQP9 mRNA表达开始上调，在缺血2 d、3 d AQP9 mRNA的表达达到高峰，缺血后5 d仍显著高于对照组(均P<0.05)。

　　2.2 脑缺血组与对照组大鼠脑组织Ca2+含量比较见表2。脑缺血后各时间点组大鼠脑组织Ca2+含量均显著高于对照组(均P<0.01)，缺血后2 d、3 d达高峰，脑缺血后5 d稍有下降。

　　2.3 AQP9 mRNA表达水平与Ca2+含量的关系 脑缺血组大鼠缺血区脑组织AQP9 mRNA表达水平与Ca2+含量变化呈正相关(r=0.7654，P<0.05)。

　　表1 脑缺血组与对照组大鼠脑组织AQP9 mRNA表达水平比较(略)

　　注：与对照组比较*P<0.05

　　表2 脑缺血组与对照组大鼠脑组织Ca2+含量比较(略)

　　注：与对照组比较*P<0.01

　　3 讨论

　　脑水肿是缺血性脑血管病中常见的并发症之一，可以引起颅内高压、病情加重，甚至死亡。目前，由于对脑缺血后脑水肿发生的机制尚不十分清楚，因此临床治疗也仅限于对症处理，不能达到标本兼治的目的。关于缺血性脑水肿的发生存在着脑微循环障碍、脑机能代谢障碍、血脑屏障障碍、自由基、钙超载、膜分子结构紊乱等多种学说。然而，这些学说均不能对其发生机制作出圆满的解释。

　　近几年来的研究表明，水分子的主动转运和平衡调节是由AQP来参与进行的。AQP是一系列具有同源性的细胞膜蛋白，迄今为止，已从哺乳类动物组织中分离克隆出10种AQP[6]，它们广泛分布于机体不同的组织器官中，介导着不同类型细胞膜的跨膜水转运。在脑组织分布有6种AQP(AQP1、AQP3、AQP4、AQP5、AQP8、AQP9)，其中，AQP9是Kuriyama等[7]在1997年进行人类脂肪组织基因序列系统分析过程中首次发现的。原位杂交免疫荧光试验观察到人类AQP9基因位于染色体15q22.1～22.2, 其与鼠有76%同源。AQP9分布于多种器官组织中。在脑组织中，其分布于脑室周围室管膜细胞、蛛网膜下腔和脑室周围的星形胶质细胞、白质及海马的星形胶质细胞、下丘脑的视上核、室旁核和视交叉上核[1，2]、松果体的腺细胞[2]。AQP9在脑组织的分布提示其对脑组织水的转运和脑脊液循环起重要作用，推测是对渗透压的变化起调节作用，可能是渗透压感受器或受体，并与下丘脑的神经内分泌功能可能有关。近年来，AQP9在脑组织水代谢疾病中的作用已引起广泛的关注。 Badaut等[8]研究发现脑缺血后，梗死灶周围的皮质、苍白球、杏仁核的星形胶质细胞AQP9免疫标记增强，提示AQP9参与水的运输和脑水肿的形成;在实验性脑创伤性损伤后，AQP9在损伤侧表达增强，而且与脑水肿的严重程度呈正相关[9]，这说明AQP9可能也是脑水肿形成的重要因素。以上研究充分说明AQP9在脑水肿的发生发展过程中起重要作用，但其作用机制目前尚不清楚。

　　本研究发现，脑缺血后大鼠脑组织AQP9 mRNA的表达是一个动态的变化过程，脑缺血后6 h，AQP9 mRNA表达已明显高于正常水平，第2 d、3 d达到峰值，以后逐渐回落，第5 d仍比对照组高，而此期正是细胞内水肿占主导地位的病理阶段，这与AQP4在出血性脑水肿的表达变化相似[10]，并且与Badaut等[8]在实验中观察到的结果基本一致。进一步证实了AQP9表达增强是形成细胞内水肿的关键因素，说明脑缺血后脑水肿的发生发展与AQP9的过度表达有密切关系。

　　Ca2+是神经细胞内重要的第二信使，其在调节细胞黏附、胞间通讯、酶活性、膜通透性、细胞代谢和多种蛋白激酶的活化具有重要作用。细胞内外存在很大的Ca2+浓度梯度差，细胞内Ca2+的稳定主要是通过3个互相依赖的系统进行调节：电压依赖性门控通道，受体或神经递质门控通道及通过细胞内第二信使的内在机制。电压依赖性通道与受体或递质通道很难精确区分，两者之间可能互相影响，电压依赖性通道可因细胞膜去极化被激活，引起Ca2+内流，当Ca2+浓度异常升高时，由于细胞内Ca2+调节的生化反应发生紊乱，磷脂酶、蛋白酶、核酸内切酶等被激活，导致细胞骨架破坏，产生不可逆损伤，最终导致细胞死亡[11]。

　　细胞内Ca2+超载是导致细胞死亡的最后共同途径。因此，测定细胞内Ca2+浓度对于了解正常细胞功能及与Ca2+有关疾病的发生机制有重要意义。Fura2是第二代荧光指示剂，具有荧光强度高，对Ca2+选择性强，不易受细胞密度及荧光指示剂浓度的影响，因而更能准确地反映细胞内Ca2+的实际浓度。本研究表明，在脑缺血6 h后，缺血侧神经细胞内Ca2+浓度比对照组明显增高，提示在急性缺血性脑水肿的早期损伤过程中，细胞内Ca2+超载是其损伤机制之一，说明缺血性脑水肿的发生和发展与Ca2+超载有着密切的关系;同时发现，脑缺血后Ca2+含量的改变与AQP9 mRNA表达水平的变化呈正相关。这一结果提示：脑缺血后AQP9基因过度表达与Ca2+超载可能是缺血性脑水肿发生发展的主要原因，AQP9和Ca2+可能共同参与缺血性脑水肿形成的信号转导。根据本实验结果和以往的发现，推测缺血性脑水肿的机制可解释为：脑缺血、缺氧导致Na+、K+ATP酶活性下降，使细胞内外渗透压失衡，激活了细胞膜外的渗透压感受器，通过信号转导(目前机制尚不明了)使AQP9基因表达增强、水通道开放、水和Na+流入细胞内增多，形成细胞内水肿。同时K+外流增加，致使神经细胞膜去极化、钙通道开放，大量的Ca2+流入细胞，引起Ca2+超载，激活了其相应的受体和电压依赖性通道，使神经细胞的蛋白质和磷脂代谢紊乱，导致严重的细胞毒性脑水肿;在细胞毒性脑水肿发生的同时由于脑血管痉挛，血脑屏障的通透性增加，从而使血管源性脑水肿加剧，导致细胞的损害加重。由此，可以推断AQP9表达上调可能是缺血性脑水肿病理损伤的重要分子机制之一，AQP9和Ca2+在缺血性脑水肿的形成过程中可能起关键性作用。提示通过抑制AQP9表达和Ca2+的内流可为减轻脑水肿提供新的治疗方法。

　　【参考文献】

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