糖尿病患者表皮厚度和汗腺神经分布的变化

　　作者：凌丽,江新梅,薛金伟,汪淼,殷飞　　作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春

　　【摘要】目的 探讨糖尿病患者表皮厚度和皮肤汗腺神经分布的变化。方法 收集正常人和糖尿病患者小腿外侧皮肤标本各20例，进行常规HE染色和胆碱酯酶组化染色，使用C5型目镜测微尺镜下测量组织切片表皮厚度，使用ImagePro Plus 6.0图像分析软件分析胆碱酯酶组化染色切片的汗腺神经分布情况。结果 与正常人比较，糖尿病患者的皮肤表皮变薄(P<0.05)，支配汗腺的胆碱能神经数量明显减少(P<0.01)，染色浅淡，密度不均，排列不规则。结论 糖尿病患者存在不同程度的皮肤营养障碍及自主神经损伤。

　　【关键词】 糖尿病,皮肤活检,表皮厚度,汗腺神经分布

　　泌汗功能作为评价自主神经功能的指标，能够反映神经损伤及再生的程度，但目前常用的泌汗功能检查方法如交感皮肤反应、淀粉碘试验等由于尚欠细致和客观，不能进行精确的定量和评价〔1〕。研究证实，支配汗腺的自主神经纤维主要为胆碱能神经纤维〔2〕，目前胆碱酯酶染色常用来观察心肌、胰腺、肌肉等组织的自主神经变化〔3〕，尚无应用此方法对支配汗腺的自主神经纤维进行评估的研究报道。本文应用胆碱酯酶染色和HE染色方法检测糖尿病患者汗腺支配神经和表皮厚度，从而了解糖尿病患者的自主神经支配情况和皮肤厚度的变化。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料

　　糖尿病患者和正常人皮肤标本各20例取自2007年1月至2008年5月在我科接受皮肤神经活检和在我院手外科、骨科急诊就诊的外伤手术患者。排除长期酗酒、药物中毒等既往有周围神经损伤的病例。糖尿病组男8例，女12例;年龄42～75岁，平均53.3岁，病程3～30年，平均14.7年;其中11例平素接受胰岛素治疗，4例口服降糖药控制血糖，余5例未规律用药;血糖平均控制在9.5～15.2 mmol/L之间，除4例有皮肤多屑、瘙痒外，其余患者均无明显肢体感觉减退及排汗异常。正常对照组选择年龄、性别与之相近的正常人群，统计学分析两组间性别、年龄无显著差异。

　　1.2 皮肤活检

　　选取足外踝上方约10～15 cm处小腿外侧皮肤，常规消毒，2%利多卡因局部麻醉，使用直径3 mm的角膜环钻环形切取皮肤全层及部分皮下组织，速入液氮中冷冻，然后于恒冷冰冻切片机中切片，片厚10 μm。所用试剂碘化乙酰硫代胆碱购自Sigma公司，余试剂均由吉林大学第一医院神经内科实验室提供。

　　1.3 皮肤表皮厚度的检测

　　光学显微镜下观察两组HE染色后皮肤结构及附属器官着色情况。采用C5型目镜测微尺(上海第三光学仪器厂)测量表皮厚度，每个活检标本至少有3张切片参加测量，每张切片至少在3个显微镜视野下进行观察，最后取其平均值，表皮厚度以表皮真皮交界处与颗粒细胞层最外层之间的垂直距离表示〔4〕。

　　1.4 皮肤汗腺神经支配的检测

　　采用改良KarnovskyRoot染色法〔5〕进行胆碱酯酶染色。冰冻切片自然风干后，经双蒸水充分浸洗，入37℃孵育液中孵育1～2 h，镜下观察染色程度，待汗腺神经呈棕红色即入双蒸水中浸洗3次，每次3 min，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察胆碱能神经着色情况。每个活检标本至少有3张切片参加测量，每张切片随机选取3个具有汗腺分布的视野进行观察。使用ImagePro Plus6.0图像分析软件对围绕汗腺的神经纤维进行鉴别和定量，结果以神经纤维的面积占汗腺管(包括神经纤维)面积的百分比表示。

　　1.5 统计学方法

　　采用SPSS11.0统计分析软件，计量数据以x±s表示，组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 表皮厚度

　　正常对照组表皮层细胞大小一致，分布均匀;糖尿病组表皮明显变薄，细胞分布及排列欠均匀，糖尿病组表皮厚度明显小于正常对照组(P<0.05)，见表1、图1。表1 表皮厚度及汗腺支配神经测量结果(略)

　　2.2 支配汗腺的神经形态学检测结果

　　支配汗腺的胆碱能神经被染成棕红色，正常胆碱能神经纤维呈环形密集地分布在汗腺小管周围，排列规则，分布均匀;糖尿病组胆碱能神经数量明显减少，分布稀疏，部分汗腺区胆碱能神经纤维消失，染色浅淡，排列不规则，密度不均，汗腺支配神经面积百分比明显小于正常对照组(P<0.01)，见表1、图2。

　　3 讨论

　　正常人表皮由内向外分为四层：基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层、角质层。因角质层内无神经、血管分布，厚度与摩擦力、劳动强度有关，因此其厚薄与否无明显临床意义，因此本文测量的表皮厚度以表皮真皮交界处与颗粒细胞层最外层之间的垂直距离表示。本实验发现，糖尿病人表皮厚度较正常人变薄。以往研究表明，神经肽和神经递质是表皮厚度的决定性因素〔6〕，它们影响角质形成细胞的增殖，其中降钙素基因相关肽、P物质和一氧化氮等是由感觉神经末梢释放的，他们是角质形成细胞增殖的潜在调节阀〔7，8〕。同时，钙离子的聚集和神经生长因子也影响角质形成细胞。糖尿病患者的皮肤变薄，可能是因为糖尿病使神经肽和神经递质等分子的分泌功能发生紊乱，同时其对皮肤的营养支持作用也受到损害，以至于皮肤厚度变薄，所以表皮厚度的改变是综合因素作用的结果。

　　糖尿病自主神经病变可在早期出现，甚至在糖尿病确诊前发生，可单纯出现，也可与其他神经病变并存〔9〕。临床主要表现在心血管系统、消化系统、泌尿生殖系统、体温调节和泌汗调节等方面。自主神经是完整神经的一个不可缺少的组成部分，其分布到皮肤上的纤维与感觉纤维分布相同，感觉消失区与无汗区相符合。周围神经损伤后感觉丧失区内的皮肤干燥无汗，随着神经的再生，出汗逐渐增多。因此检查泌汗功能，能判断神经损伤及再生的程度〔1〕。目前临床中关于泌汗功能的检查主要包括泌汗轴突反射定量试验、汗印试验、温控排汗试验、交感皮肤试验等，但大多由于较复杂、方法操作繁琐、设备昂贵不易实施;或受周围环境、温度影响，难以客观定量，而不适用于临床研究〔10〕。本研究首次采用皮肤神经活检结合胆碱酯酶染色的方法对皮肤汗腺的神经支配情况进行病理学观察，并从形态学和分布数量上进行探索研究。本文观察到糖尿病患者跟正常人比较，汗腺的神经支配存在数量的减少和分布的不均匀。且20例糖尿病患者中临床表现出泌汗功能异常的仅有少数，但是皮肤标本切片中却可以看到多数患者的汗腺神经均不同程度的减少，且分布不均。这可能也说明了糖尿病所致的这种病理改变要先于甚至重于临床症状。因此本实验方法对糖尿病性自主神经病变具有早期诊断的作用。

　　【参考文献】

　　1 沈宁江，朱家恺.自主神经功能评价在周围神经损伤和修复中的临床应用〔J〕.中华显微外科杂志,1994;17(3):1789.

　　2 李伯埙.现代实用皮肤病学〔M〕.西安:世界图书出版公司,2007:1,4.

　　3 徐京惠，薛红杰，赵玲辉,等.大鼠心肌梗塞后梗塞区胆碱能神经支配的变化〔J〕.解剖学杂志,2001;24(6):5604.

　　4 Chang HY，Huang LT，Chen WP,et al.Regional difference in epidermal thinning after skin denervation〔J〕.Exp Neurol,1998;154:13745.

　　5 方德福.现代医学实验技巧全书〔M〕.北京:北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社,1995:1489.

　　6 Fuchs E.Epidermal differentiation: The bare essentials〔J〕.J Cell Biol,1990;111:280714.

　　7 Benrath JM，Zimmermann M，Gillardon F.Substance P and nitric oxide mediate would healing of ultraviolet photo damaged rat skin: evidence for an effect of nitric oxide on keratinocyte proliferation〔J〕.Neurosci Lett,1995;200(1):1720.

　　8 Takahashi KS，Nakanishi S，Imamura S.Direct effects of cutaneous neuropeptides on adenylyl cyclase activity and proliferation in a keratinocyte cell line: stimulation of cyclic AMP formation by CGRP and VIP/PHM，and inhibition by NPY through G proteincoupled receptors〔J〕.J Invest Dermatol,1993;101: 64651.

　　9 向明珠，金元欣.糖尿病植物神经病变〔J〕.临床荟萃,1993;8(11): 4813.

　　10 夏婷，李双庆.糖尿病自主神经病变〔J〕.华西医学,2004;19(3):5256.