中国人阿尔茨海默病与乙二醛酶Ⅰ基因A111E多态性相关分析

　　作者：颜振兴,刘振华,吴多斌　　作者单位：南方医科大学珠江医院神经内科，广东 广州

　　【摘要】目的 探讨乙二醛酶Ⅰ (GLOⅠ) 基因A111E多态性在中国汉族人中的分布特点及其与阿尔茨海默病(AD)的相关性。方法 收集102例AD者和121例健康对照者，使用限制性内切酶SfaNI的PCRRFLP法检测乙二醛酶Ⅰ基因多态性。结果 AD组A111E位点E型等位基因型频率(18.6%)明显高于健康对照组(9.9%)(P<0.05);E型等位基因者发生AD的危险性增加;AD组与健康对照组比较，基因多态性频率分布(AA:68.6%,81.8%;AE：25.5%,16.5%;EE：5.9%,1.7%),差异有统计学意义(χ2=6.185，P<0.05)。结论 GLOⅠ基因多态引起的GLOⅠ功能性氨基酸突变与AD的发生及进展相关。

　　【关键词】 乙二醛酶Ⅰ,基因多态性,阿尔茨海默病

　　在人体细胞内，糖的氧化产物乙二醛与蛋白质氨基反应或由糖酵解产物甘油醛3磷酸转变成甲基乙二醛(MG)，MG与蛋白质反应形成晚期糖基化终产物(AGEs)〔1〕。在还原型谷胱甘肽作为辅助因子的条件下，MG可通过乙二醛酶(GLO)Ⅰ和GLOⅡ被还原成D乳酸盐而解毒,从而降低AGEs的形成。Sasaki等〔2〕经免疫组化检测到阿尔茨海默病(AD)者脑内有高水平的AGEs表达。也有文献报道在体外培养的高表达人的GLOⅠ基因的牛内皮细胞可降低细胞内AGEs的形成〔3〕。目前国内外尚无关于中国汉族人群中GLOⅠ与AD相关的报道。笔者推测人体中AGEs水平的升高可能与AD病人的GLOⅠ活性或酶量降低而不能及时去除升高的MG有关，而GLOⅠ活性可能又与此酶基因单核苷酸多态性有关。本研究旨在探讨该基因多态与AD的相关性。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 采用病例对照研究， AD组102 例，男 56例，女46例;平均年龄(73.6±8.6)岁。 纳入标准：全部患者应用简易智力状态检查表检查，按 ICD10临床诊断标准，把诊断为“可能AD”的患者列为观察对象，所有患者对实验知情同意。排除标准：有阳性家族史者。正常对照组为北京市万寿路地区健康老年人，简易智力状态检查评分在28 分以上，共121例， 男57例，女64例;平均年龄(69.6±5.4)岁。所有被试者对实验均知情同意，两组年龄、性别等具可比性。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA提取 取周围静脉血2 ml，枸橼酸钠抗凝后用苯酚氯仿法提取白细胞基因组DNA。

　　1.2.2 GLOⅠ基因多态和PCRRFLP测定 PCR反应:引物根据文献设计〔4〕，位于GLOⅠ基因的外显子4内,由上海博亚公司合成，序列为：上游5′TCAGAGTGTGTGATTTCGTG3′，下游5′CATGGTGAGATGGTAAGTGT3′。(2)PCR 反应体系：PCR 总反应体积为 50 μl，其中 DNA 模板 3.0 μl，10×Buffer 2.0 μl，Premix Taq 酶(大连宝生物工程公司)25 μl，20 μmol/L上、下游引物各 1 μl 以及灭菌去离子水 18 μl。(3)PCR 反应条件：预变性 94℃、4 min，每个循环变性94 ℃、30 s，退火 55 ℃、30 s，延伸 68 ℃、60 s，35 个循环后 68 ℃终末延伸 5 min。PCR 反应后取酶切产物 8 μl 进行 1.0%琼脂糖凝胶(含EB 0.5 mg/L) 电泳。(4)RFLP 检测及电泳分析：取上述 PCR 扩增产物 10 μl，10×Buffer 2 μl，特异性限制性内切酶 SfaNⅠ(NEB公司，浓度为0.2U/μl)1 μl，灭菌三蒸水7 μl，总反应体积为 20 μl，于37℃反应 3 h。取酶切产物 8 μl 进行 1.0%琼脂糖凝胶(含 EB 0.5 mg/L) 电泳，紫外线灯下观察酶切结果并记录分析。

　　1.3 统计分析 从凝胶照片上直接判读个体基因型。基因频率采用基因计数法，使用SPSS13.0统计软件进行χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 PCR 扩增产物酶切后分型 共分3种基因型 野生型a(A/A) 718 bp，杂合型b(A/E) 718、444、274 bp，突变纯合型c(E/E) 444、274 bp，见图1。

　　1，2，7，8，9：杂合型b(A/E)，4：突变纯合型c(E/E)，3，6，10：野生型a(A/A)，5：未出现条带

　　图1 GLOⅠ基因A111E位点PCR产物酶切电泳图谱

　　2.2 AD组与正常对照组等位基因频率比较 见表1。两组比较有显著性差异(χ2=4.789，P<0.05)。

　　2.3 AD组与正常对照组GLOⅠ基因SfaNⅠ多态性频率比较 见表2。各基因型在AD组和正常对照组间分布差异有显著性意义(χ2=6.185，P<0.05)。运用PCRRFLP法检测出本组中国人样本中GLOⅠ基因A111E多态的两种等位基因A、E。AD组及健康组中都见到三种基因型,即AA、AE、EE。表1 AD组与健康对照组SfaN I等位基因频率比较表2 AD组与健康组SfaN I位点基因型多态性频率分布的比较

　　3 讨 论

　　AGEs指体内蛋白质中氨基与还原糖的羰基在无酶条件下发生非酶糖化反应,其高级阶段形成不溶性、不被酶降解的交联体。研究证实AGEs与AD发病具有相关性：(1)通过蛋白降解介导免疫应答，引起炎症反应〔5〕。(2)对皮质神经元的直接损害作用〔6〕。GLO作为参与AGEs形成的限速酶存在于人体各种组织中,遗传方式为共显性遗传方式,共有6个外显子,mRNA全长1 993 bp，DNA全长12 085 bp〔7〕。Zn+结合在此酶的活性位点上,构成活性中心〔8〕。文献报道第100到111位氨基酸是GLOⅠ的保守序列〔9〕,所以它的改变可能造成GLOⅠ功能的改变。且近来的研究认为GLOⅠ基因C419A导致Ala111Glu ，该位点突变与自闭症有相关性〔6〕。Sidoti〔10〕指出GLOⅠ基因 A111E多态是多发性硬化的一项低危险因素。同时也有报道1例末期肾病患者GLOⅠ酶活性低于其他肾病患者,而糖基化终级产物含量高于其他肾病患者〔11〕。本实验中,AD组及健康对照组均以野生型AA基因多见,分别为68.6%和81.8%;但在杂合型AE基因所占的比例中,AD组明显比对照组高,分别是25.5%和16.5%;令人注目的是突变型EE基因,AD组的百分比是对照组的3倍多。将AD组与正常对照组GLO1基因SfaNI多态性频率进行比较，发现各基因型分布差异有显著性意义(χ2=6.185，P<0.05)。AD组与正常对照组等位基因频率比较有显著性差异(χ2=4.789，P<0.05)。实验结果提示GLOⅠ基因A111E多态性与AD遗传易感性相关，携带突变基因E可以增加散发性AD的发病率,基因分布频率与人类基因组计划结果相近。

　　GLOⅠ基因 A111E多态性对AD具体影响机制可能是GLOⅠ基因C419A导致Ala111Glu 改变了GLOⅠ基因结构与功能，使GLOⅠ酶量减少、酶活性降低〔4〕，从而导致MG代谢障碍和AGEs的形成增多，促进AD的发生发展。MG可导致①细胞损伤:Zhang〔12〕等证明MG可选择性抑制细胞内线粒体呼吸和糖酵解,诱导细胞调亡;②基因突变:MurataKamiya〔13〕研究发现MG诱导在哺乳动物细胞内复制的supF基因碱基置换(G:C向C:G和T:A转换);③直接性神经损伤：AD临床主要表现之一为记忆、认知障碍，而DiLoreto证明MG通过氧化应激介导海马神经元损伤,上调白介素yβ和神经生长因子表达。AGEs通过以下的途径影响AD:(1)对交联蛋白质沉积的修饰。AD的标志是淀粉样斑和神经原纤维缠结，AGEs在精氨酸和赖氨酸残基上对淀粉样斑和神经原纤维缠结进行修饰,修饰后的淀粉样斑和神经原纤维缠结同小神经胶质细胞的相互反应导致了AD早期的炎性反应〔14〕。(2)促进细胞凋亡。和MG一样，AGEs使病变区域的神经元离开G0期,在G1/S和G2/M相，AGEs抑制细胞生长周期，促进神经元发生凋亡 〔15〕。(3)促进氧化应激。GasicMilenkovic〔16〕证明了在神经元细胞SHSY5Y家系中，AGEs以剂量依赖性的形式诱导了脂质过氧化。(4)促进可诱导型一氧化氮合酶的表达。Wong〔17〕比较了正常老年个体与AD大脑颞叶皮质同时有AGEs和可诱导型一氧化氮合酶沉积的星形胶质细胞,发现年轻的对照组中不存在有AGEs和可诱导型一氧化氮合酶沉积的星形胶质细胞;老年个体和早期AD的浅层神经元存在少量的AGEs和可诱导型一氧化氮合酶沉积的星形胶质细胞;晚期AD在浅深层神经元都存在有AGEs和可诱导型一氧化氮合酶沉积的星形胶质细胞,而且星形胶质细胞的密度更大。在AD中,星形胶质细胞被AGEs激活并表达了可诱导型一氧化氮合酶。(5)影响细胞的转运系统。Reber〔18〕报道AGEs能使神经元细胞(NG10815)和神经胶质细胞(主要是星形胶质细胞)囊泡分布发生改变和囊泡的分泌减少,同时,也可以使细胞转运系统重要组成部分蛋白dynamin 2和clathrin的分布发生同样改变。综上所述，GLOⅠ基因多态引起的GLOⅠ功能性氨基酸突变与AD的发生及进展相关。关于GLOⅠ基因C419A导致Ala111Glu，该位点突变导致GLOⅠ基因结构与功能改变的具体机制有待进一步实验验证。

　　【参考文献】

　　1 Nicholl ID，Bucala R.Advanced glycation endproducts and cigarette smoking〔J〕.Cell Mol Biol (Noisylegrand)，1998;44(7):102533.

　　2 Sasaki N,Toki S,Chowei H,et al.Immunohistochemical distribution of the receptor for advanced glycation end products in neurons and atrocities in Alzheimer′s disease〔J〕.Brain Res,2001;88(2):25662.

　　3 Shinohara M,Thornalley PJ,Giardino I,et al.Overexpression of glyoxalaseI in bovine endothelial cells inhibits intracellular advanced glycation endproduct formation and prevents hyperglycemiainduced increases in macromolecular endocytosis〔J〕.J Clin Invest,1998;101(5):11427.

　　4 Junaid MA，Kowal D，Barua M,et al.Proteomic studies identified a single nucleotide polymorphism in glyoxalase I as autism susceptibility factor〔J〕. Am J Med Genet A，2004;131(1):117.

　　5 Thornalley PJ.Glutathionedependent detoxification of alphaoxoaldehydes by the glyoxalase system：involvement in disease mechanisms and antiproliferative activity of glyoxalase I inhibitors〔J〕.Chem Biol Interact，1998;111112:13751.

　　6 Takeuchi M，Bucala R，Suzuki T,et al.Neurotoxicity of advanced glycation endproducts for cultured cortical neurons〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，2000;59(12):1094105.

　　7 Thornalley PJ.The glyoxalase system:new developments towards functional characterization of a metabolic pathway fundamental to biological life〔J〕.Biochem J,1990;269(1):111.

　　8 Richter U,Krauss M.Active site structure and mechanism of human glyoxalase Ian ab initic theoretical study〔J〕.J Am Chem Soc,2001;123(29):697382.

　　9 Lan Y,Tianfen L,Lovett PS,et al.Evidence for a(triosephosphate isomeraselike)“catalytic loop” near the active site of glyoxalase I〔J〕. J Biol,1995;270(22):1295760.

　　10 Sidoti A，Antognelli C，Rinaldi C,et al.Glyoxalase I A111E，paraoxonase 1 Q192R and L55M polymorphisms：susceptibility factors of multiple sclerosis〔J〕?Mult Scler，2007;13(4):44653.

　　11 Miyata T,Strihou C,Imasawa T,et al.Glyoxalase I deficiency is associated with an unusual level of advanced glycation end products is a hemodialysis patient〔J〕.Kidney Intern,2001;60(6):23515.

　　12 Zhang X，Harrison DH，Cui Q.Functional specificities of methylglyoxal synthase and triosephosphate isomerase：a combined QM/MM analysis〔J〕.J Am Chem Soc，2002;124(50):148718.

　　13 MurataKamiya N，Kamiya H，Kaji H,et al.Methylglyoxal induces G:C to C:G and G:C to T:A transversions in the supF gene on a shuttle vector plasmid replicated in mammalian cells〔J〕.Mutat Res，2000;468(2):17382.

　　14 Munch G，Kuhla B，Luth HJ，et al.AntiAgeing defences against Alzheimer′s disease〔J〕.Biochem Soc Trans,2003;31 (pt6)：13977.

　　15 Munch G，GasicMilenkovic J，Arendt T，et al.Effect of advanced glycation end products on cell cycle and their relevance foe Alzheimer′s disease〔J〕.J Neutral Transm Suppl，2003;(65)：6371.

　　16 GasicMilenkovic J，Loske C，Munch G，et al.Advanced glycation end products cause lipid peroxidation in the human neural cell line SHSY5Y〔J〕.J Alzheimers Dis,2003;5(1):2530.

　　17 Wong A，Luth HJ，Deutherconrad W，et al.Advanced glycation end products colocalized with inducible nitricoxide synthase in Alzheimer′s disease〔J〕.Brain Res，2001;920(12)：3240

　　18 Reber F，Reber U，Funk RH.Intracellular changes inastrocyted and NG 10815 neuroblastoma X gliome cells induced by advanced glycation end products〔J〕.J Neural Transm，2003;110(10):110318.