脂蛋白脂酶基因多态性与缺血性脑卒中的相关性研究

　　作者：杨玉梅,吴江,杜丹华,高鹏,王凤　　作者单位：吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春

　　【摘要】目的 探讨脂蛋白脂酶(LPL)基因多态性与缺血性脑卒中发病的相关性。方法 选择600例缺血性脑卒中患者和419例对照组人群，以位于LPL基因的PLRrs326位点为遗传标记，应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法，检测LPL基因的多态性。结果 病例组GG基因型频率明显高于对照组(P<0.05);动脉粥样硬化性脑梗死组G变异等位基因频率与对照组相比差异显著。结论 LPL rs326位点基因多态性与缺血性脑卒中的发病相关。

　　【关键词】 脑梗死,脂蛋白脂酶基因,单核苷酸多态性

　　【Abstract】 Objective To investigate the association between lipoprotein lipase (LPL) rs326 polymorphism and ischemic stroke. Methods A casecontrol study of 1 019 subjects was performed including 600 acute ischemic stroke patients and 419 controls. LPL rs326 genotypes were determined by PCRRFLP. Results The frequency of GG genotype of rs326 was significantly higher in patients group than that in control group (P<0.05). 600 patients were divided into cerebral thrombosis infarction group and lacunar infarction group, and the distribution of LPL rs326 G allete was different significantly between cerebral thrombosis infarction group and control group. Conclusions LPL rs326 polymorphism is associated with the pathogenesy of cerebral thrombosis infarction.

　　【Key words】 Cerebral infarction; LPL gene;Single nucleotide polymorphism/SNP

　　缺血性脑卒中是一种多基因遗传病，其发生与个体遗传易感性和环境因素的相互作用有关〔1〕。脂代谢相关基因是脑梗死遗传学研究重要的候选基因〔2〕。脂蛋白脂酶(LPL)在脂质代谢和转运过程中发挥重要作用，LPL基因突变会引起脂质代谢紊乱,与动脉硬化、高血压及肥胖的发生相关联〔3〕，而动脉硬化、高血压是缺血性脑血管病的发病基础，因此其与缺血性脑卒中的关系广受关注。本研究首次选取LPL基因上的rs326位点，探讨其与缺血性脑卒中发病的关系,为缺血性脑血管病的早期预警提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　选择中国北方汉族脑梗死患者和排除脑梗死的健康人为研究对象。受试者共1 019人，其中病例组600例，为2005年10月至2006年6月在我科住院的脑梗死患者，平均年龄(60.4±11.5)岁。所有患者均符合1995年中华医学会第四届脑血管病会议修订的各类脑血管疾病诊断要点，由两名神经科医生根据详细的神经科检查、头CT和/或MRI扫描确诊为脑梗死，并除外潜在的心源性栓子和周围血管栓塞性疾病、大动脉炎、外伤、血液病、药物、恶性肿瘤、血管畸形或动脉瘤等引起的脑梗死。按TOAST〔4〕分型标准，分为动脉粥样硬化性脑梗死343例、腔隙性脑梗死257例。对照组419例，来自我院体检中心同期健康体检人群，与病例组的年龄、性别相匹配。所有研究对象均有完整的临床资料,包括性别、年龄、体重指数(BMI)、既往史、吸烟、饮酒史、家族史、血生化指标(血糖、血脂)、头CT或MRI检查结果，部分病人行脑彩超和颈部血管彩超检查。所有入组病例均签属知情同意书。

　　1.2 引物设计

　　利用国际互联网在人类基因库中对LPL的SNPs进行检索,选定第8内含子上的rs326位点,根据引物设计原则设计引物，上游：5′AGG CAG ATG CCC TAA TTC C3′，下游:5′CAC CCT GTG GAA GAA AAT GG3′。

　　1.3 人外周血白细胞基因组DNA的提取

　　所有研究对象均于清晨空腹经肘前静脉取血2 ml,肝素抗凝。取300 μl用Promega基因组快速提取试剂盒提取基因组DNA。

　　1.4 基因型检测

　　采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法。(1)PCR反应体系为23 μl,其中双蒸水14.2 μl，0.92 mmol TrisHCl(pH8.3)，46 mmol KCl,1.5 mmol MgCl2,4种dNTP各200 μmol,引物各1.5 μmol，Taq DNA聚合酶1.0 U(Promega,北京)，基因组DNA 30～50 ng。(2)PCR反应条件:94℃预变性5 min,95℃变性45 s，57℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min。 (3)限制性酶切PCR扩增产物:用MspⅠ对PCR产物进行酶切。酶切体系：PCR产物17 μl，MspⅠ0.8 U,10×Buffer 2 μl,BSA 0.2 μl。酶切反应条件: 37℃水浴4～6 h。酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳(90 mmV)50 min,凝胶成像系统(UVP，美国)观察结果。

　　1.5 统计学分析

　　应用拟和优度检验分析病例组和对照组基因型频率的分布是否符合HardyWeinberg(HW)平衡;UNPHASED遗传学软件应用cocaphase对等位基因频率进行分析;采用SPSS15.0软件包，应用χ2检验对基因型频率进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 研究对象的一般情况

　　病例组与对照组间性别、年龄、BMI无明显差异。对研究对象的LPL rs326位点进行拟和优度检验，缺血性脑卒中组(χ2=0.077,P=0.78)和对照组(χ2=3.315,P=0.068)基因型分布均未偏离HW平衡。

　　2.2 LPL基因型在病例组和对照组的分布

　　病例组GG基因型频率明显高于对照组(P<0.05)。对梗死类型的分层分析未发现动脉粥样硬化性脑梗死组和腔隙性脑梗死组该位点基因型分布与对照组比较有显著性差异，对性别的分层分析亦未发现有显著性差异(见表1)。表1 对照组、病例组及分层后各亚组rs326基因型频率的分布〔n(略)〕

　　2.3 LPL等位基因频率在病例组及对照组的分布

　　病例组与对照组相比无统计学意义(P>0.05)，对梗死类型的分层分析显示动脉粥样硬化性脑梗死组与对照组相比，有显著性差异(P=0.047);相对于A等位基因，G等位基因OR=0.757(95% CI 0.568～1.010)，腔隙性脑梗死组无显著性差异，对性别的分层分析亦未发现显著性差异(见表2)。表2 对照组、病例组及分层后各亚组rs326等位基因频率的分布〔n(略)〕

　　3 讨论

　　动脉粥样硬化(AS)是脑梗死的主要病理学基础，LPL在AS过程中起双重作用:一方面血浆LPL水解循环中的极低密度脂蛋白及乳糜颗粒内的甘油三酯(TG),从而降低血浆中TG及增加高密度脂蛋白(HDL)水平,有利于阻止AS;另一方面,血管壁LPL有致AS的作用,其水解极低密度脂蛋白(VLDL)及乳糜颗粒后产生小体积的富含胆固醇的裂解产物及游离脂肪酸,后两者被巨噬细胞摄取后可转化为泡沫细胞〔5〕,且还能刺激血管壁平滑肌细胞增生,使动脉壁增厚〔6，7〕，促进AS的形成。

　　人LPL基因位于8p22，约30 kb，含有10 个外显子和9个内含子。编码含 475 个氨基酸残基的蛋白质，其中包括一条由 27 个氨基酸残基组成的信号肽，经过翻译修饰后，信号肽被切除，产生含 448 个氨基酸残基的成熟 LPL 分子。LPL基因突变已达105种,遍及调控区、内含子和外显子,是已报告的基因突变最丰富的蛋白质之一。本研究选择位于第8内含子上的rs326位点进行检测，发现G等位基因携带者患大动脉粥样硬化性脑梗死的危险高于非携带者。由于内含子区基因突变不会改变基因产物的序列，不直接影响LPL活性,该位点多态性对脑梗死发病的影响可能是由于：(1)该位点与其他多态性位点存在连锁不平衡,以相互或相加的方式影响其转录、表达和调控。(2)最近有研究发现,当内含子中间的碱基变异激活隐性剪切位点影响剪切时,可导致某些疾病,有些内含子中间的碱基变异尽管不影响剪切,也可能与疾病有关〔8〕。(3)某些内含子可含有编码与它们活动有关的蛋白质的基因〔9〕。由于本研究样本取自中国北方汉族人，尚需在不同民族的不同群体中进行重复，提供更可靠的结论。

　　【参考文献】

　　1 Dominiczak AF,McBride.Genetic of common polygenic stroke〔J〕. Nature Genetic，2003;35(2):1167.

　　2 尚蔚，吴晓东.基因多态性与脑卒中关联研究〔J〕.中国分子心脏病学杂志，2003;3(6):3715.

　　3 杜纪坤,黄青阳.脂蛋白脂酶基因的研究进展〔J〕.中华医学遗传学杂志，2007;29(1):816.

　　4 Adams HP Jr,Bendixen BH,Kapplle LJ,et al.Classification of subtype of acute ischemic stroke,defination for use in a multicenter clinical trial〔J〕. Stroke,1993;24(1):3541.

　　5 Goldberg IJ,Merkel M.Lipoprotein lipase: physiology，biochemistry,and molecularbiology〔J〕.Front Biosci,2001;6:D388405.

　　6 Mamputu JC,Levesque L,Renier G.Proliferative effect of lipoprotein lipase on human vascular smooth muscle cells〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000;20：22129.

　　7 官国东，徐恩，王小娟，等.脂蛋白脂酶Ser447stop基因多态性与动脉硬化性脑梗死的相关研究〔J〕.中华医学遗传学杂志，2006;23(6):51922.

　　8 王晓斌,刘国仰.有关内含子功能研究的新进展〔J〕.中华医学遗传学杂志,2000;17:21121.

　　9 Mount S,Henikoff S.Gene organization:nested genes take flight〔J〕.Curr Biol,1993;3:3724.