肝豆状核变性T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化

　　作者：汪瀚,杨文明,鲍远程,陈怀珍,童建兵　　作者单位：安徽中医学院第一附属医院神经内科 合肥

　　【摘要】 目的 研究肝豆状核变性(Wilson病，WD)患者的T淋巴细胞亚群及NK细胞亚群变化,并探讨其临床意义。方法 应用流式细胞仪直接免疫荧光染色法测定49例WD患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞亚群,并与健康人组进行对照,同时对不同ChildPugh分级患者的T细胞亚群及NK细胞进行比较分析。结果 WD组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+较对照组水平无明显变化，NK水平较对照组降低(P<0.05);病情重者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平仍无差异，随病情加重NK水平显著降低(P<0.01)。结论 WD存在NK细胞免疫失调,而T淋巴细胞免疫功能正常,病情重的患者NK细胞免疫功能更低。

　　【关键词】 Wilson病,T淋巴细胞亚群,NK细胞亚群,流式细胞仪

　　【Abstract】 Objective To study the changes and its clinical significance of T lymphocyte subsets and natural kill cells in Wilson’s disease patients.Methods T lymphocyte subsets and natural kill cells were measured in 49 patients by the FCM direct immunofluorescent staining technique and compared with normal controls. Meanwhile patients were also compared with each other in different ChildPugh rating.Results The levels of CD3+，CD4+，CD8+，CD4+/CD8+ in WD were normal, the levels of natural kill cells decreased compared with healthy controls(P<0.05). As compared with Child-Pugh rating A, the levels of NK were declined more significantly in severe patients who were ChildPugh rating B and C(P<0.01).The difference of CD3+，CD4+，CD4+/CD8+ levels was not significant.Conclusion T lymphocyte immune function is not difference and immune disturbance of NK are observed in WD patients. The levels of NK are even significantly lower in severe patients.

　　【Key words】 Wilson’s disease;T lymphocyte;Natural kill cell;FCM

　　肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration, HLD),也称Wilson病(Wilson’s disease，WD),是一种常染色体隐性遗传性铜代谢障碍性疾病,均存在不同程度的肝功能异常和损害。肝功能损害在肝豆状核变性中表现较突出，其中免疫调控功能紊乱亦是参与慢性肝损伤的重要原因之一,为探讨WD病人T细胞亚群、NK细胞与机体细胞免疫功能紊乱的关系, 我们采用流式细胞仪技术对WD患者进行T淋巴细胞亚群及自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)的测定，分析并探讨其在WD病情进展过程中的作用及临床意义,现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 Wilson病组:共49例,为200608～200612安徽中医学院第一附属医院神经内科住院确诊病例，男31例,女18例,年龄8～59岁,平均(21.10±10.56)岁。平均病程(7.14±6.74)年, 平均发病年龄 (13.89±5.30)岁。ChildPugh分级A级16例,B级28例,C级5例。正常对照组:共24例,为健康志愿者,其中男13例,女11例,年龄12～46岁,平均(23.57±7.39)岁。排除自身免疫性疾病、肿瘤、急性炎症、使用免疫抑制剂者,血常规及肝肾功能正常。

　　1.2 方法 外周血T淋巴细胞亚群及NK杀伤细胞检测使用美国Beckman Coulter EPICS XL4C型流式细胞仪,采用微量全血直接免疫荧光染色法。全部受检者均于清晨空腹抽取肘静脉血1ml,取肝素抗凝血100u，分别加入20u荧光标记的FiTcCD3CD16+56、FiTcCD4/CD8单克隆抗体,混匀后置室温18～20℃孵育15min,加红细胞溶解液1ml待红细胞溶血后,离心洗涤2次,用流式细胞仪检测,以阳性百分率计算结果。

　　1.3 统计学处理 数据以均数±标准差表示, 成组、成对资料均数比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 WD组和对照组性别比较 在WD组、正常对照组中,按性别进行比较,T细胞亚群各项指标均无组间差异(P>0.05)。见表1。

　　表1 WD组性别间和对照组性别间的T细胞亚群分析比较(略)

　　2.2 WD组与对照组T细胞亚群、NK细胞测定 WD组和正常对照组中的T细胞即CD3+、 CD4+、CD8+ 、CD4+/CD8+淋巴细胞的百分比差异则无显著性意义 (P>0.05), WD组患者NK细胞差异有显著性意义 (P<0.01)。见表2。

　　表2 WD组与对照组T细胞亚群、NK细胞测定比较(略)

　　组间比较：**P<0.01

　　2.3 不同ChildPugh分级WD患者T细胞亚群、NK细胞之间的比较 当肝功能损害达到ChildPugh分级B、C级时，与A级比较NK细胞水平差异有显著性意义(P<0.01)。见表3。

　　表3 不同Childpugh分级WD患者T细胞亚群、NK细胞之间的比较(略)

　　B级、A级组间比较：**P<0.01;C级、A级组间比较：##P<0.01

　　3 讨论

　　WD是以铜代谢障碍为特征的常染色体隐性遗传病,由于基因(13q14.1)突变,其编码的蛋白(ATP7B)发生改变,导致血清铜蓝蛋白合成减少和胆道排铜障碍,铜离子在肝、脑(尤其是基底节)、肾、角膜等沉积,表现为肝硬化、锥体外系症状、肾功能损害、角膜KF环等。[1]目前对于WD患者T细胞亚群、NK细胞指标的检测，迄今国内外报道较少。

　　人类白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)系列单克隆抗体可识别T淋巴细胞表面抗原决定簇,其中CD3+代表T细胞总数,CD4+和CD8+代表T辅助诱导亚群(ThTy)和抑制杀伤亚群(TsTc)。CD4+细胞主要指Th细胞,可促进B细胞、细胞毒T细胞(CTL)及其他免疫细胞增殖和分化。CD8+细胞中Ts细胞可对抗Th细胞功能,Tc细胞则能特异性地杀伤携带抗原的靶细胞。正常情况下,这些免疫细胞相互制约,形成机体的免疫网络,维持机体的正常免疫功能。某一淋巴细胞亚群数量或功能发生异常时,机体免疫平衡紊乱,可发生一系列病理损伤[2]。一般认为CD4+与CD8+之比应为1.3～2.1:1，临床上常用Th/ Ts比值来判断病人的免疫状态。

　　NK约占循环淋巴细胞的15%,能迅速产生细胞因子和趋化因子,且无需预先致敏即能杀伤肿瘤和被病毒感染的靶细胞, 在早期抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用,所以NK细胞是非特异性免疫系统的主要组分之一[3]。从检测发现肝豆状核变性患者CD3+、CD4+、CD8+，CD4+/CD8+比值均无明显变化，而NK细胞则具特异性变化。肝豆状核变性NK细胞减少，主要原因可能与NK细胞多分布于外周血和脾脏，在淋巴结和其他组织中只有少量存在[4]。而铜沉积于WD患者肝脏造成肝细胞灶性坏死和纤维增生，最终导致结节性坏死性肝硬变，往往同时继发脾功能亢进，以致检测外周血NK含量减少，说明WD患者存在一定程度的非特异性免疫功能下降缺陷。

　　外周血T淋巴细胞及其亚群分析是公认的反映机体细胞免疫状态的较好指标。ChildPugh分级法是评价肝功能储备、肝硬化程度的良好指标。检测发现，在ChildPugh分级B、C级与A级比较，NK细胞有统计学差异显著性意义，而CD3+、CD4+、CD8+，CD4+/CD8+比值均无明显变化。正常情况下, T淋巴细胞在淋巴器官及外周血的数目和亚群的比例相对恒定,机体得以维持正常的免疫状态。NKC是不同于T、B淋巴细胞而具有直接杀伤靶细胞效应的一个特殊淋巴细胞系,是机体免疫监视的主要成分,具有细胞免疫和免疫调节作用。结果显示,不同程度的肝损害WD患者外周NK细胞有着不同程度的降低。T细胞亚群变化不明显,可能主要因肝脏是体内铜中毒的原发靶器官和铜主要沉积的部位[5];过量铜在肝细胞内沉积,导致肝细胞的变性坏死，而肝脏的损害可通过对体内抗原肝处理能力减弱、细胞因子紊乱、肠源性内毒素血症、门脉高压症以及物质代谢、生物转化功能障碍等多方面因素对免疫系统有着广泛影响,使得NKC计数及活性降低等。故肝功能损害加重到ChildPugh分级B、C级时，非特异性免疫功能出现进一步紊乱，这表明患者免疫监视功能的下降。

　　综上所述, WD患者存在一定程度的非特异性免疫功能缺陷，免疫状态紊乱，表现为NKC功能低下，T细胞介导的细胞免疫功能未见减弱，应用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞和NK细胞等指标可用于临床WD患者的细胞免疫状态监测，这对于深入研究WD的病理生理机制有一定意义。以上临床观察结论限于病例数有限，尚需进一步研究总结。

　　【参考文献】

　　1] 中华神经病学分会.肝豆状核变性的诊断与治疗指南[J].中华神经科杂志，2008，41(4)：566.

　　[2] 朱晓玲,王军,林宜,等.流式细胞仪检测中国人外周血淋巴细胞亚群正常值[J].中国医学检验杂志,2003,4(2):100101.

　　[3] French AR, Yokoyama WM. Natural killer cells and viral infections[J]. Curr Opin Immunol， 2003，15:4551.

　　[4] 陈慰峰主编.医学免疫学[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2004:9394.

　　[5] Sternlieb. Wilson’s disease[J]. Clin Liver Dis, 2000, 4 (1): 229239.