同种异体脂肪组织提取液对大鼠创面愈合的影响

　　作者：章安源，李海红 ，王君　(中国人民解放军第304医院，北京 100037 病理科; 全军创伤修复重点实验室)

　　[摘要]目的 研究同种异体脂肪组织提取液对大鼠皮肤创面愈合的影响。方法 18只大鼠随机分成3组，在每只大鼠背部制备2个全层皮肤缺损创面，脂肪组织提取液组用同种异体脂肪组织提取液0.2 mL，基质对照组用磷酸盐缓冲液(PBS)0.2 mL，分别滴于创面，每天1次;空白对照组不滴加任何制剂。采用创面面积、伤腔容积和组织学指标评价创面愈合效果。结果 伤后7 d脂肪组织提取液组创面面积和伤腔容积均明显小于基质对照组和空白对照组( F= 105.51、8.67，q=4.29～18.71，P <0.05)。组织学检查显示脂肪组织提取液组创面肉芽组织和新生表皮生长明显。伤后14 d脂肪组织提取液组创面愈合情况优于基质对照组和空白对照组( F=96.47，q= 17.73 、16.82，P <0.05)。结论 同种异体脂肪组织提取液可加快大鼠皮肤创面愈合的速度，改善愈合质量。

　　[关键词] 脂肪组织;组织提取物;皮肤损伤;伤口愈合

　　EFFECTS OF HOMOLOGOUS ADIPOSE TISSUE EXTRACTS ON WOUND HEALING IN RATS

　　ZHANG AN-YUAN， LI HAI-HONG， WANG JUN

　　(Department of Pathology， No. 304 Hospital of PLA， Beijing 100037， China)

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the effects of homologous adipose tissue extracts on wound healing after skin injury in rats. MethodsEighteen Wistar rats were randomly divided into three groups， namely adipose tissue extracts-treated group， PBS control group， and blank control group. Full-thickness wounds were made on the back of the rats (two wounds for each rat) followed by the above treatment once a day. Wound areas and volumes， as well as histology marker were used to evaluate the effects on wound healing. ResultsAt day 7 after injuries， the areas and the volumes of injuries in the extracts-treated group were decreased significantly compared with those in the two control groups ( F=105.51，8.67;q=4.29-18.71;P <0.05)， while granulation tissue and nascent epidermis grew more obviously in the extracts-treated group than those in the two control groups ( F= 96.47;q=17.73，16.82;P <0.05). At day 14 after injuries， the wound healing in the extracts-treated group was superior to the other two. ConclusionHomologous adipose tissue extracts can accelerate velocity and improve the quality of wound healing after skin injury in rats.

　　[KEY WORDS]adipose tissue;tissue extracts;skin injury;wound healing

　　近来研究表明，脂肪组织除了具有人们熟知的几种生理功能外，还含有多种功能干细胞和某些促进伤口愈合的生长因子[1]。随后又有报道小型猪自体脂肪颗粒移植可以加速创面愈合，小型猪脂肪组织提取液能够促进大鼠离体皮肤生长[2，3]。这些研究结果提示脂肪组织提取液可能具有促进伤口愈合的作用，因此本实验观察了同种异体脂肪组织提取液对大鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 制备同种异体脂肪组织提取液 Wistar大鼠2只，雄性，体质量210～230 g。麻醉后切取背部皮下和腹股沟处的皮下脂肪垫。称质量，用灭菌的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)进行10倍稀释，冰浴匀浆。在4 ℃条件 下，以3 000 r/min的转速离心10 min，吸取上清液，微孔滤膜过滤除菌，分装-20 ℃冻存。

　　1.2 制备全层皮肤缺损创面 Wistar大鼠18只，雄性，体质量210～230 g。实验当日大鼠禁食，用速眠新肌肉注射麻醉，速眠新的应用剂量为0.4 mL/kg体质量。大鼠麻醉后，背部剃毛，用体积分数0.75的乙醇常规消毒。用直径18 mm的环钻在大鼠脊柱两侧各压出1个圆形印迹(2.54 cm2 )，外科手术剪刀沿压痕剪去全层皮肤(达深筋膜)，即每只大鼠背部各制成2个圆形全层皮肤缺损创面，止血备用。

　　1.3 实验动物分组 将上述18只大鼠随机分成3组。脂肪组织提取液组:致伤后创面给予0.2 mL同种异体脂肪组织提取液;基质对照组:致伤后创面给予灭菌的PBS 0.2 mL;空白对照组:致伤后创面不给予任何制剂。

　　1.4 给药方法 将同种异体脂肪组织提取液和PBS分别吸入 1 mL 无菌注射器内，每个创面滴注0.2 mL，并涂布均匀。贴敷单层油纱布，然后用4层无菌纱布覆盖，胶布固定。大鼠均单笼喂养，自由进食饮水，同种异体脂肪组织提取液和PBS分别每天给予1次，至伤后14 d结束。

　　1.5 评价指标及方法 ①大体观察:直接观察大鼠创面大小、形状、肉芽组织生长、创缘新生表皮移行等情况。②创面面积:伤后0、3、7和14 d用无菌透明载玻片覆盖创面，用记号笔沿创面边缘描绘出创面，再用平整厚度均匀的透明塑料膜复制并剪下该创面图样，以万分之一电子分析天平(德国，Sartorus A 120S)测定透明塑料膜图样的质量，并换算成相应创面的面积(首先测定透明塑料膜单位面积的质量，mg/cm2 )[4]。③伤腔容积:伤后0、3和7 d向伤腔内滴注无菌生理盐水，记录滴至伤腔液面与创缘皮肤平行时的液量(mL)[4]。④组织学检查:伤后7、14 d取各组创面组织，进行组织学检查。伤后7 d注射致死剂量的速眠新处死大鼠9只，余者14 d处死。切取整个创面，包括5 mm无损伤的正常皮肤，切至筋膜，标本放入100 g/L甲醛溶液中固定。固定后从创面中心部位切开，取其中一半常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红(H-E)染色。用光学显微镜观察创面肉芽组织生成和新生表皮生长情况。

　　1.6 统计学分析 用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计学处理，创面面积和伤腔容积均以 x±s 表示，组间比较采用方差分析。

　　2 结果

　　2.1 大体观察 伤后3 d各组创面比致伤当天略有缩小，呈椭圆形。伤腔均稍微变浅，肉芽组织增生均不明显。脂肪组织提取液组创面新鲜、易出血，创缘无新生表皮生长。两个对照组创面略显苍白、不易出血，也未见明显肉芽组织生长和新生表皮长出。伤后7 d，各组创面明显缩小，呈不规则椭圆形。以脂肪组织提取液组创面缩小更为明显，肉芽组织明显增多，伤腔已被肉芽组织填平，少数创面肉芽组织略高于创面，创缘新生表皮生长较明显;两个对照组肉芽组织和表皮生长较少，部分创面仍存在一定伤腔。到伤后14 d各组创面进一步缩小，脂肪组织提取液组创面 多呈椭圆形，两个对照组多呈长条形。脂肪组织提取液组创面肉芽组织基本与创面持平，表皮继续增生逐渐覆盖整个创面，两个对照组则有部分残留创面未愈。

　　2.2 创面面积 伤后3 d，各组创面面积与致伤当天相比稍有缩小。伤后7 d，创面明显缩小，其中以脂肪组织提取液组创面缩小最为明显。在伤后14 d各组创面接近愈合。见表1。

　　2.3 伤腔容积 伤后3 d，各组创面伤腔开始减小;伤后7 d，各组创面伤腔都很小。脂肪组织提取液组比空白对照组和基质对照组的伤腔减少更显著。见表2。

　　表1 伤后不同时间各组创面面积(略)

　　注:括号内为样本例数。与空白对照组、基质对照组比较， F=105.51，* q=18.71、16.45，P <0.05; F=96.47，△ q=17.73、16.82，P <0.05

　　表2 伤后不同时间各组创面伤腔容积(略)

　　与空白对照组、基质对照组比较， F=8.67，* q=4.29、5.71， P < 0.05

　　2.4 组织学检查 切片经H-E染色后，镜下可见，伤后7 d各组创面肉芽组织均有不同程度的生长和白细胞浸润，创缘有新生表皮生成。脂肪组织提取液组创面肉芽组织增加较多，毛细血管和成纤维细胞更明显，创缘新生表皮生长明显增多。基质对照组和空白对照组创面成纤维细胞和毛细血管较少，肉芽组织较薄，创缘仅有较少的新生表皮移行生长。伤后14 d脂肪组织提取液组创面肉芽组织逐渐成熟，毛细血管减少，纤维细胞和胶原增多。而基质对照组和空白对照组肉芽组织仍较幼稚，毛细血管较多，成纤维细胞较少。脂肪组织提取液组创面可见较多的新生表皮(图1)，比两个对照组多，而且大多数创面已被新生表皮覆盖，创面已经愈合。基质对照组(图2)和空白对照组(图3)伤口仍残留。

　　图1 伤后14 d脂肪组织提取液组创面组织学检查结果 H-E 染色 ×200(略)

　　图2 伤后14 d基质对照组创面组织学检查 H-E染色 ×200 (略)

　　图3 伤后14 d空白对照组创面组织学检查 H-E染色 ×200 (略)

　　3 讨论

　　创面愈合是一些病人经常涉及的问题，人们也 一直在探讨如何加快创面愈合的速度和改善创面愈合的质量。某些外源性生长因子已被证实具有促进创面愈合的作用[5]。近年来，逐渐发现脂肪除具有储存能量、提供营养等作用外，还能分泌多种因子和激素。为此本实验研究了同种异体脂肪组织提取液对大鼠全层皮肤缺损创面修复的影响， 以了解其促进创面愈合的作用。本实验观察到脂肪组织提取液对大鼠背部全层皮肤缺损创面有促进肉芽组织增生的作用。脂肪组织提取液组创面伤腔明显小于基质对照组和空白对照组，肉芽组织的增生为新生表皮从创缘生长提供了良好的生长移行载体。脂肪组织提取液对创面有促进新生表皮生长移行的作用。脂肪组织提取液组创面面积明显小于基质对照组和空白对照组。实验结果表明，脂肪组织提取液对大鼠背部全层皮肤缺损创面的修复有促进作用。

　　脂肪组织提取液促进大鼠背部全层皮肤缺损创面修复的作用机制，可能是脂肪分泌的生长因子促进肉芽组织和新生表皮生长。脂肪可以分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)和胰岛素样生长因子(IGF)，VEGF和IGF是促进血管内皮细胞增殖、迁移的重要因素[6]。脂肪组织提取液促进创面修复的作用可能与VEGF和IGF有关，也可能是脂肪组织提取液内除了VEGF和IGF外，还含有其他体液中含有的多种营养物质。脂肪组织来源广泛，脂肪组织提取液制备简单，脂肪组织提取液比脂肪颗粒使用更为方便，更容易被病人所接受。因此，脂肪组织提取液有可能成为一种新的治疗创面的制剂。

　　[参考文献]

　　[1] ZUK PA， ZHU M， ASHJIAN P， et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. Mol Biol Cell， 2002，13:4279-4295.

　　[2] 方利君，付小兵，孙同柱，等. 猪自体脂肪移植修复皮肤损伤的初步研究[J].解放军医学杂志，2004，29(7):577-579.

　　[3] 鲁刚， 付小兵， 李海红，等. 脂肪组织提取液促进大鼠皮肤生长的实验研究[J].中国危重病急救医学，2005， 17(2): 87-88.

　　[4] 孙同柱，付小兵，赵志力，等. 重组人血小板源性生长因子凝胶剂促进糖尿病大鼠创面愈合的实验研究[J].中国危重病急救医学，2003，15(15):596-599.

　　[5] 付小兵，沈祖尧，陈玉林，等. 碱性成纤维细胞生长因子与创面修复―― ―1 024例多中心对照实验[J].中国修复重建外科杂志，1998，12(4):209-211.

　　[6] WABITSCH M， HEINZE E， DEBATIN K M， et al. IGF-Ⅰ and IGFBP-3 expression in cultured human preadipocytes and adipocytes[J]. Horm Metab Res， 2000，32:555-559.