酒精性肝损伤过程中经CYP2E1代谢的探针药物氯唑沙宗镇痛效应的变化

　　作者：康晓琳1 薛永志1 许秀举2 刘和莉1 作者单位：(1.包头医学院药理学教研室， 2.营养与食品卫生教研室， 内蒙古包头 014060)

　　【摘要】 目的：通过观察酒精性肝损伤过程中经CYP2E1代谢的探针药物氯唑沙宗镇痛效应的变化，建立一种有效反映CYP2E1代谢活力变化的方法。方法：采用白酒灌胃法复制大鼠酒精性肝损伤模型，采用肝脏组织HE染色法及血清中ALT和AST水平测定检测大鼠肝损伤情况，通过热板实验判定氯唑沙宗镇痛效应的变化，从而反映氯唑沙宗的特异性代谢酶CYP2E1代谢活力的变化。结果：酒精性肝损伤模型组大鼠肝脏表现为轻度到中度脂肪变性和炎性细胞浸润，并且酒精性肝损伤模型组大鼠CYP2E1代谢活力明显增强(P<0.01)。结论：白酒灌胃法成功地复制了大鼠酒精性肝损伤模型，通过热板实验观察氯唑沙宗镇痛效应的变化可以作为判断CYP2E1代谢活力变化的一种方便、有效、快捷的方法。

　　【关键词】 酒精性肝损伤;热板实验;氯唑沙宗

　　The Changes in the Analgesic Effect of Probe Drug Chlorzoxazone

　　Metabolized by CYP2E1 on Alcoholic Liver Injury in Rats

　　KANG Xiaolin1, XUE Yongzhi 1, XU Xiuju2, LIU Heli1

　　(1.Department of Pharmacology,Baotou Medical College,Baotou 014060,China;

　　2.Department of Nutrition and Food Hygiene, Baotou Medical College)

　　Abstract Objective: The purpose of the present study was to establish an effective method which can reflect the changes in CYP2E1 metabolic activitiy by observing the analgesic effect of chlorzoxazone(CZX). On alcoholic liver injury. Methods: The models of alcoholic liver injury in Wistar rats were established by feeding them with white wine. The liver histopathology was revealed by hematoxylin and eosin (HE) method and serum concentration of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST). Results: The liver histopathology in ethanol group revealed mild-to-moderate steatosis and mild necroinflammation. Ethanol treatment significantly elevated hepatic CYP2E1 metabolic activitiy(P﹤0.01). Conclusion：The models of alcoholic liver injury in Wistar rats were established successfully with intragastric method of white wine. It is a convenient and effective method for determining the changes in CYP2E1 metabolic activity to observe the changes in the analgesic effect of CZX by hot-plate test.

　　Key words Alcoholic liver injury; Hot-plate test; Chlorzoxazone

　　酒精性肝损伤是由于长期大量的酒精摄入而引起的以肝脏脂肪变性，炎性细胞浸润，甚至纤维化为特征的一种中毒性肝脏疾病。在我国近年来随着人均酒精消耗量的显著增长，酒精性肝损伤的发病率也呈逐年上升趋势, 在一些地区已经成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因[1]。酒精性肝损伤致病原因单一，但是发病机制比较复杂，很多研究认为细胞色素P450 2E1(cytochrome P450,CYP2E1)与酒精性肝损伤有密切关系。CYP2E1主要在肝脏表达，CYP2E1是许多低分子有机化合物及药物在体内的主要代谢酶,如乙醇、蒽氟烷、氟烷、氯唑沙宗、对乙酰氨基酚及烟草中的许多成分等均通过CYP2E1 在体内进行生物转化。其中氯唑沙宗能在体内外作为CYP2E1探针药物反映其活性[2]。有报道，非酒精性脂肪性肝病患者对CYP2E1探药氯唑沙宗的代谢可以较好反应肝脏损伤的程度[3]。对氯唑沙宗代谢情况的观察通常是采用高效液相色谱(high-performance liquid chromatography，HPLC)法观察氯唑沙宗及其主要代谢物6-羟氯唑沙宗药代动力学参数的变化[4]，这种方法操作复杂，条件要求高，并且耗时长。我们采用白酒灌胃法复制大鼠酒精性肝损伤模型[5]，通过观察氯唑沙宗的镇痛效应的变化建立一种方便、快捷、高效地反映CYP2E1代谢活力变化的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 Wistar大鼠，清洁级，雄性24只，体重200±20 g，动物许可证号SCXK(蒙)2002-0001，购自内蒙古大学实验动物中心。

　　1.2 药物与仪器 56度红星二锅头由北京红星股份有限公司生产;氯唑沙宗片剂由山东省医药工业研究所提供;RH-200智能热板仪;奥林帕斯显微镜。

　　1.3 动物分组及造模 Wistar大鼠24只，经1周的喂养适应后，随机分为两组，1组(Control，n=12)经灌胃给予生理盐水20 mL/(kg·d)，每天2次，至20 d;2组(Ethanol，n=12)给予56度红星二锅头，20 mL/(kg·d)，每天2次灌胃，至20 d。

　　1.4 样品采集 于实验前一晚禁食，第21天先将所有大鼠称重，将每组大鼠再分为两小组，共4组(Control组、Control+CZX组、Ethanol组、Ethanol+CZX组)，将Control+CZX组和Ethanol+CZX组经灌胃给予探针药物氯唑沙宗(80 mg/kg)，并于给药1.5 h后，将各组大鼠逐一置于50 ℃热板上，同时计时，记录大鼠第一次舔后足的时间，作为舔足反射潜伏期，并记录大鼠5 min内舔后足的次数。再经内眦静脉取血4 mL，3 500 rpm，离心10 min，抽取血清2 mL，置-20 ℃冰箱冷冻，待测血清中ALT、AST水平。随后将大鼠颈椎脱臼处死，迅速剖取肝脏，称重，将肝组织浸泡于事先配好的甲醛酒精(甲醛∶酒精=1∶9)固定液中，常规HE染色，光镜下观察肝脏的组织形态。

　　1.5 统计学处理 实验结果用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件，用单因素方差分析进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠肝脏病理学、生化指标的改变 Ethanol组大鼠与Control组相比毛色无光泽，易激惹，食欲不佳，体重增加量明显减少(P<0.01);Ethanol组大鼠肝脏颜色淡黄，质稍软，无光泽，肝脏重量/大鼠重量×100%大于Control组(P<0.01);光镜下可见Ethanol组肝脏出现轻度到中度的脂肪变性和炎性细胞浸润(图1);同时测得Ethanol组大鼠血清AST、ALT均较Control组升高，以ALT升高为明显。详见表1。表1 两组大鼠体重增加、肝重系数、血清转氨酶含量比较

　　2.2 热板法测定各组大鼠氯唑沙宗的镇痛效应 经灌胃给予80 mg/kg氯唑沙宗1.5 min后，将大鼠置于50 ℃热板上，观察5 min，Control+CZX组与Control组相比，大鼠的舔足反射潜伏期明显延长(P<0.01)，5 min内舔后足次数也明显减少(P<0.01)。Ethanol+CZX组与Control+CZX组相比，大鼠的舔足反射潜伏期明显缩短(P<0.01)，5 min内舔后足次数也明显增加(P<0.01)。详见表2。表2 各组大鼠氯唑沙宗的镇痛效应

　　3 讨论

　　本研究通过白酒灌胃法复制大鼠酒精性肝损伤模型，符合人类饮酒的习惯，能更好地模拟人类酒精性肝损伤。实验结果显示，Ethanol组大鼠体重增加量明显低于Control组，肝重系数明显大于Control组，同时HE染色结果显示Ethanol组大鼠肝脏出现轻度到中度脂肪变性，炎性细胞浸润;血生化检查ALT和AST明显升高，表明成功地建立了大鼠酒精性肝损伤模型。

　　目前的研究认为，当血和肝组织乙醇浓度较低时，大部分乙醇由乙醇脱氢酶氧化代谢，但长期酗酒而使肝组织乙醇浓度超过10 mmol/L时，乙醇氧化系统被激活，CYP2E1对乙醇代谢起主要作用[2]。同时乙醇又是CYP2E1酶的诱导剂，乙醇不仅能够诱导CYP2El 酶活性增加，还能使它的表达增加。研究证实饮酒者肝组织中亦有CYP2E1的表达和活性增强[6]。本实验通过热板实验观察经CYP2E1代谢的探针药物氯唑沙宗的镇痛效应的变化来反映CYP2E1代谢活力的变化。50 ℃的热板刺激大鼠后足产生疼痛，迫使大鼠通过舔足来减轻疼痛，因此各组大鼠均出现了舔后足的反应。而氯唑沙宗具有镇痛的效应，可以增加大鼠对热板的耐受程度。因此,通过观察热板上大鼠镇痛效应的变化来反映体内氯唑沙宗的血药浓度，从而反映CYP2E1代谢活力的变化。实验结果显示当Control+CZX组和Ethanol+CZX组大鼠给予80 mg/kg的氯唑沙宗后，与Control组相比都出现了不同程度的疼痛缓解，表现为舔足反射潜伏期延长、舔足次数减少，表明氯唑沙宗很好地发挥了镇痛效应。然而Ethanol+CZX组与Control+CZX组相比出现了舔足反射潜伏期缩短、舔足次数增多，表明Ethanol+CZX组氯唑沙宗镇痛效应减弱，提示Ethanol+CZX组大鼠体内氯唑沙宗药物浓度降低，反映CYP2E1代谢活力增强，这与其它研究的结果一致[6]。

　　通过热板实验观察CYP2E1探针药物氯唑沙宗镇痛效应的变化，可以反映CYP2E1的代谢活力的变化，这种方法与HPLC法相比操作简单，无须复杂的方法学建立，更加省时高效。为我们今后研究CYP2E1代谢活力的变化提供一种新的尝试，氯唑沙宗其它药效学的指标是否也可以用来衡量CYP2E1代谢活力的变化有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] 王安莲,石年.酒精性肝病研究进展[J].安徽预防医学杂志,2009,15(6):454-458.

　　[2] 朱海针,魏文树.细胞色素P4502E1与酒精性肝病[J].海峡药学,2008,20(10):11-14.

　　[3] Orellana M, Rodrigo R, Varela N, et al. Relationship between in vivo chlorzoxazone hydroxylation, hepatic cytochrome P450 2E1 content and liver injury in obese non-alcoholic fatty liver disease patients[J].Hepatology Research,2006,34(1):57- 63.

　　[4] Ahn CY, Bae SK, Jung YS, et al. Pharmacokinetic parameters of chlorzoxazone and its main metabolite, 6-Hydroxychlorzoxazone, after intravenous and oral administration of chlorzoxazone to liver cirrhotic rats with diabetes mellitus[J]. Drug Metab Dispos,2008,36(7):1233-1241.

　　[5] 朱平生，庞亚丽，王宇亮，等.大鼠急性酒精性肝损伤模型的脂质过氧化损伤观察[J].中华中医药杂志,2006,21(6):376-377.

　　[6] Gemma S, Vichi S, Testai E. Individual susceptibility and alcohol effects: biochemical and genetic aspects[J]. Ann Ist Super Sanita,2006,42 (1):8-16.