硅胶膜管联合组织工程骨修复兔桡骨缺损实验研究

　　作者：崔建德, 裴国献**, 江 汕， 戴金良， 王秋实， 赵培冉， 梁双武 作者单位：(南方医科大学南方医院 创伤骨科实验室， 广东 广州 510515)

　　【摘要】 目的： 探讨硅胶膜复合组织工程骨修复兔桡骨缺损的效果。方法： 在新西兰大白兔左、右侧桡骨中段制作长1.5 cm的骨与骨膜缺损，左侧采用硅胶膜包裹组织工程骨修复缺损为实验组，右侧单纯用组织工程骨修复缺损为对照组;术后3、6、9个月通过肉眼观察，组织学观察和生物力学检测，评价硅胶膜复合组织工程骨修复兔桡骨缺损的效果。结果： 术后3个月实验组可见局部成熟的成骨区域，优于对照组;实验组6个月成熟成骨区域增大，可见明显血管;实验组9个月成骨区域基本上都是成熟胶原纤维，且结构排列规则，血管明显;生物力学检测发现实验组的压缩刚度、抗扭转刚度、三点弯曲最大载荷、抗折弯刚度都明显优于对照组。结论： 硅胶膜包裹组织工程骨修复骨缺损效果良好，不但能促进骨组织的生长和成熟，并且能明显提高骨组织的力学性能;硅胶膜除了可以限制纤维组织的长入，还可以引导血管的长入和其他营养物质聚集在组织工程骨内，很好地发挥屏障和引导作用。

　　【关键词】 骨缺损; 硅胶膜; 组织工程骨; 引导性组织再生; 兔

　　An Experimental Study on Repair of Rabbit Radial Defect with

　　Silica Gel Membrane Combined with Tissue-engineered Bone

　　CUI Jiande, PEI Guoxian, JIANG Shan, DAI Jinliang, WANG Qiushi， ZHAO Peiran, LIANG Shuangwu

　　(Department of Orthopaedics and Traumatology, Nanfang Hospital, Nanfang

　　Medical University, Guangzhou 510515,Guangdong, China,)

　　[Abstract] Objective: To study the efficacy of silica gel membrane (SGM) with tissue-engineered bone in repair of rabbit radial defect. Methods: Defects measured 1.5 cm of bone and periosteum were artificially made in both right and left radial bones of 18 healthy New Zealand rabbits. The left defects were treated with SGM wrapped with tissue-engineered bone as experiment group, and the right ones were treated with tissue-engineered bone only as control group. Histological changes of defects were examined in 3, 6, and 9 months after the implantation. By the end of 9 months, all animals were sacrificed and biomechanical strength of the radius was analyzed. Results: By the end of the 3rd month, mature new bone regions were found in experiment group, but not in control group. By the end of the 6th month, more mature new bone regions with plenty of capillary were found in experimental group. By the end of the 9th month, the ossification zone of experimental group was almost filled by mature collagen fibers and the texture was regular with obvious capillary. The biomechanical strength of radius in experiment group showed no significant statistical difference from that of normal radius (P>0.05) , but was better than that in control group (P<0.05). Conclusions: SGM combined with tissue-engineered bone shows good effects in repairing of rabbit radial defect both in promoting the growth and maturing of bone tissue, and in raising the biomechanic strength of bone. The mechanism might be that SGM has an important effect in protecting defect area from invading of connective tissue and guiding the regeneration of capillary.

　　[Key words] bone defect; silica gel membrane; tissue-engineering bone; inductive bone regeneration; rabbits

　　创伤与肿瘤等疾病所致的骨缺损是临床棘手问题，自体骨移植仍是解决此类问题的金标准，但是自体骨来源有限，难以满足临床需要。骨组织工程技术的发展为解决此类问题开辟了一条途径，但是如何促进组织工程骨在体内存活仍是一道难题。有学者认为应用人工膜管封闭骨缺损区,阻挡纤维组织长入成骨区和防止骨缺损区内的诱导因子向外扩散,可能更有利于骨缺损区新生骨组织的生长[1，2]。2006年9月～2007年12月利用硅胶膜管包裹组织工程骨修复兔桡骨缺损，并采用组织学和生物力学方法检测硅胶膜管对组织工程骨成骨效果的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 组织工程骨的制备

　　新西兰大白兔18只(南方医院实验动物中心提供)，雌雄不拘, 6月龄,体重2～3 kg。采用速眠新和阿托品复合液肌肉注射麻醉后于兔双侧髂骨处共抽取红骨髓2 ml，并按文献方法[3]培养扩增骨髓间充质干细胞，至第4代时将其按(4～6)×106个/ml的密度接种到直径4 mm、多孔β-磷酸三钙(购自武汉华威公司)圆柱型支架上构成组织工程骨细胞材料复合体，体外培养7 d备用。

　　1. 2 骨缺损模型的制备及处理

　　动物麻醉消毒后,沿前肢桡骨中段纵行切开皮肤,逐层分离软组织至桡骨,切断桡尺骨间膜,于桡骨中段截除1.5 cm桡骨,制成双侧前肢桡骨缺损模型。每只动物左侧为组织工程骨联合硅胶膜修复缺损组，右侧为组织工程骨修复缺损对照组。硅胶膜包绕骨缺损方法为:取16#医用硅胶导尿管的气囊部分，修剪成2 cm×1.5 cm，放置在缺损处桡骨与尺骨间，放置组织工程骨后用缝线闭合硅胶膜开口，注意硅胶膜必须覆盖桡骨两断端各2.0 mm,之后逐层闭合皮肤。术后每天肌注青霉素40万单位，连续3 d。

　　1.3 检测方法

　　1.3.1 大体标本观察 于手术后3、6、9月每组各处死6只动物取材,观察修复断骨的表面变化、骨痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。

　　1.3.2 组织学观察 将术后各时间段所取各组标本用10%甲醛固定,复合EDTA-Na2脱钙液脱钙,石蜡包埋, 连续做5 μm厚横行及纵行切片，行HE染色和MASSON染色观察其成骨情况。

　　1.3.3 生物力学检测 取实验组和对照组术后9月骨缺损愈合的尺桡骨及正常尺桡骨各5根于MTS2858万能材料实验机上作抗扭转、垂直压缩及三点弯曲试验,计算机记录测试数据并绘制力位移曲线,根据曲线计算其扭转刚度、压缩刚度及最大折断力和抗折弯刚度。

　　1.3.4 统计学处理 数据以x±s表示,采用SPSS 10. 0统计软件进行完全随机设计方差分析,同一时间点各组间的差异SNK法比较。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　术后1、2 d所有动物精神、饮食稍差，活动少，无畏寒发热，全身未见皮疹。手术伤口无红肿、渗液，3 d后精神好转，饮食正常，活动增加。

　　2.2 标本肉眼观察

　　3个月时，硅胶膜包裹组的组织工程骨部位有较多的硬度较高的骨样组织，表面无纤维样物质包裹，但组织工程骨与桡骨断端的连接不紧密(图1);而在单纯组织工程骨组中的材料表面有一层纤维样物质包裹，并且其中有少量毛细血管，组织硬度较低，容易破碎。6个月时，硅胶膜包裹组的组织工程骨中有更多的较硬的骨样组织，表面有较多的毛细血管，组织工程骨与桡骨断端结合紧密，连接处骨样组织较多(图2);而单纯组织工程骨组中缺损处有大量的纤维组织包裹，毛细血管消失，硬度较前增加。9个月时，硅胶膜包裹组的组织工程骨硬度较前明显提高，表面有一层较硬的骨样组织覆盖，其内可见血管样结构，组织工程骨与桡骨断端结合紧密(图3);而单纯组中组织工程骨表面被一厚层纤维样组织覆盖，血管样结构消失。

　　2.3 组织学切片观察

　　3个月时，硅胶膜包裹组行HE染色可见大量的岛状和融合状成骨样物质，并可见未降解的材料;MASSON染色可见成骨样物质大部分为绿色的未成熟胶原纤维，有少量的红色成熟胶原纤维，主要分布在骨细胞和岛状成骨的边缘上，排列不齐(图4)。单纯组织工程骨组中HE染色也可见少量的岛状成骨样物质和较多的未降解材料，MASSON染色显示成骨样物质为未成熟胶原纤维。6个月的时候，硅胶膜包裹组中，HE染色可见大块成骨样物质，但排列无规则，并可见较多的血管样结构，MASSON染色显示组织大多数为成熟胶原纤维(图5)。单纯组织工程骨组中HE染色可见成骨样物质多为岛状，融合的较少，血管样物质不多见，MASSON染色可见成骨样物质中成熟和不成熟的胶原纤维大致相当，纤维排列不规则。9个月时，HE染色可见硅胶膜包裹组中成骨样组织面积增加，排列规则，并可见较多血管，MASSON染色显示骨样物质基本上是成熟的胶原纤维，排列规则(图6);而单纯组织工程骨组中，HE染色显示融合的成骨样物质增加，但结构排列不齐，血管样结构不多见，MASSON染色显示骨样物质中成熟的胶原纤维比不成熟的胶原纤维多。

　　2.4 生物力学检测

　　硅胶膜包裹组各生物力学性能稍差于正常尺桡骨组，但经方差分析，除压缩刚度与正常尺桡骨组比较有统计学意义(P<0.05)外，其抗扭转刚度、三点弯曲最大载荷、抗折弯刚度与正常组比较差别无统计学意义(P>0.05)。单纯组织工程骨组各生物力学指标均低于硅胶膜包裹组，其差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　3 讨论

　　骨缺损的修复不同于一般的骨折治疗, 是骨科领域的一大难题。骨组织工程技术的发展为解决此类难题提供了新的途径，但是如何促进组织工程骨在体内的存活和提高其生物力学性能仍是限制其临床应用的重要因素。近年来引导性组织再生(Guided Tissue Regeneration,GTR)技术的发展为骨组织工程的发展开辟了新的领域。Urist[4 ,5 ]指出：只有在骨折断端成骨速度快于周围组织侵入骨折区的速度时,才能保证骨缺损的正常愈合。GTR技术可借助于膜管的屏障作用,阻挡纤维组织细胞长入创口,并能引导具有成骨潜能的组织细胞进入骨缺损区，促进创口愈合。表1 新西兰兔9个月时实验组、对照组与正常组尺桡骨生物力学指标比较

　　GTR技术实施过程中的重要一环，是在膜管内保留一定间隙，如果没有供新生骨组织生长的空间,会严重地影响新骨生长的数量和质量,甚至可能妨碍骨组织的正常生长。Leiggener[6]等将聚乳酸化合物植入缺损区，以确保膜下空间的维持。Donos等[7]将自体骨移植至骨缺损区，覆盖聚四氟乙烯膜，发现移植骨片吸收比对照组明显减慢，并保持更长期的体积稳定性。Giardino[8]等在兔桡骨骨缺损区放置脱钙异体骨基质、外包聚乳酸膜，3个月后新骨生成量明显优于对照组。本实验中管内选择多孔β-磷酸三钙作为支架载体，其生物相容性及各项性能较佳，且实验证明本材料不影响骨髓间充质干细胞在其表面的攀附及生长，能够为新骨的生长提供良好的环境，并且能够防止膜管变形，为成骨提供了足够的空间，是理想的填充材料。

　　Kuboto等[9]人认为,采用GTR技术的膜管应当足够坚固,以抵抗周围组织的压迫而变形。本实验使用的硅胶膜管厚度较薄为1 mm，具有较强的支撑能力，因其为惰性材料，植入到动物体内无任何的炎症反应及不适，因此应用于本实验较为合适。

　　研究认为，相对应用单纯组织工程骨，硅胶膜包裹组织工程骨修复骨缺损能明显促进骨组织的修复及提高其力学性能。硅胶膜的作用除了能屏蔽外周纤维组织的长入[10]，防止其干扰骨髓间充质干细胞代谢及分化成熟外，还可以保护和稳定血肿[11]，引导两骨缺损残端释放的营养物质及各种因子聚集到组织工程骨中[8]，同时也可以作为各种因子的释放载体[12～15]，有利于组织工程骨在体内的存活及成骨作用。本实验中可见，硅胶膜包裹组在各时期的成熟胶原纤维都较单纯组织工程骨多，且排列规则，同时血管的分布也较多，猜测血管的长入可能与骨残端上骨膜或骨组织本身的血管出芽再生有关，因为硅胶膜已经屏蔽了外周血管长入的可能性;并且硅胶膜包裹的组织工程骨的力学性能大大优于单纯组织工程骨，与正常骨组织相比无明显的差异。

　　使用硅胶膜包裹组织工程骨修复骨缺损效果良好，不但能促进骨组织的生长和成熟，并且能明显提高骨组织的力学性能。硅胶膜除了可以限制纤维组织的长入，还可以引导血管的长入和其他营养物质聚集在组织工程骨内，很好地发挥屏障和引导作用

　　【参考文献】

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