蛋白酶-抗蛋白酶失衡在兔肺挫伤中的作用

　　作者：陈建明，吴学祥，蒋耀光，范士志，李天星，胡德耀 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所心脏外科，重庆 400042;兰州军区总医院心脏外科，甘肃 兰州 730050;第三军医大学大坪医院野战外科研究所，重庆 400042)

　　摘要： 目的 研究蛋白酶-抗蛋白酶失衡在兔创伤性肺挫伤中的作用。方法 家兔随机分为2组，创伤组(n=8)和对照组(n=8)，采用兔单侧肺挫伤生物撞击模型，动态观察血浆中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、α1抗胰蛋白酶(α1AT)、肿瘤坏死因子α(TNFα)及白介素8(IL8)含量变化;活杀动物后取肺组织比较湿/干重比值(W/D)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)的变化，观察支气管肺泡灌洗液(BALF)中上述细胞因子和炎症介质的变化，进行肺组织的病理学光镜检查。结果 创伤组与对照组相比较，血浆和BALF中NE的活性升高、血浆α1AT含量先降低后升高、TNFα、IL8含量均明显升高(P<0.01或P<0.05)，兔肺组织损伤以肺出血、水肿和中性粒细胞(PMN)浸润为主要表现。结论 肺挫伤后，PMN激活并释放NE,使蛋白酶-抗蛋白酶失衡，在创伤性急性肺损伤中有重要的作用。

　　关键词：弹性蛋白酶;α1抗胰蛋白酶;蛋白酶;抗蛋白酶;肺挫裂伤;肺损伤

　　Role of proteaseantiprotease imbalance in pulmonary contusion in rabbits

　　CHEN Jianming,WU Xuexiang,JIANG Yaoguang,et al.

　　(Department of Cardiothoracic Surgery,Institute of Surgery Research,Daping Hospital，Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

　　Abstract: Objective To investigate the role of proteaseantiprotease imbalance in pulmonary contusion after the chest impact trauma in the rabbits.Methods Rabbits were randomly divided into two groups: traumatic group (n=10) and the normal control group (infusion of saline,n=8).The isolated lung contusion model of the rabbit was established,induced by a bioimpact machine.The plasma concentrations of elastase and α1antitrypsin (α1AT) were determined.The changes in tumor necrosis factorA(TNFα) and interleukin8(IL8) contents were measured both in plasma and bronchalvelor lavage fluid (BALF).The contents of malondialdehyde (MDA) and myeloperoxidase (MPO) were detected in the lung tissue.The wet/dry weight ratio,the contents albumin in BALF and the histological features of lung were examined.Results Compared with the control group,the activity of NE,TNFα and IL8 was increased both in plasma and BALF,but the concentrations of α1AT were reduced initially,and then elevated later in plasm.The contents of MDA and MPO were raised in the lung tissue.The ratio of W/D and albumin in BALF were higher than that of the control group(P<0.01 or P<0.05).Pathological examination revealed marked changes，including alveolar hemorrhage, pulmonary edema,leukocyte extravasation and infiltration.Conclusion The imbalance of proteaseantiprotease might play an important role in the pathogenesis of traumatic pulmonary contusion.

　　Key words:elastase;alphal1antitrypsin;protease;antiprotease;lung contusion;lung injury

　　肺挫伤病理变化主要为肺出血、肺水肿和肺不张等[1，2]，除创伤直接对肺组织的损害以外，早期出现的中性粒细胞(polymorphonuclear granulocytes,PMN)的激活、内皮细胞的粘附和PMN的渗出、浸润等为特点的、炎性级联反应是急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的重要发病机制，其可进一步发展为成人呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能衰竭[3](MOF),其发病率和死亡率均较高。

　　弹性蛋白酶(NE)是一种丝氨酸蛋白溶解酶，主要来自肺内中性粒细胞和肺泡巨噬细胞，粒细胞的激活导致弹性蛋白酶的释放，引起肺主质和间质的损害。研究表明NE在ALI的发病中有多种致炎作用[4，5]。在正常生理情况下，体内有多种蛋白酶抑制剂，阻止NE的释放而保护肺组织，其中最重要的是α1抗胰蛋白酶(α1AT)，与其结合成蛋白酶-抗蛋白酶复合物[6，7]。有实验显示，应用抗α1抗胰蛋白酶的生物制剂对ALI有治疗作用[8，9]。而应用特异性的NE抑制剂，对ALI也具有抗炎作用[7]。说明蛋白酶的抗蛋白酶的失衡在ALI的发病中起重要作用,但其在创伤性肺损伤中作用还未可知。本实验通过模拟肺挫伤动物模型，研究NE在创伤性急性肺损伤中的作用，探讨蛋白酶―抗蛋白酶平衡在肺挫伤中的变化,以及其对炎性反应的影响。

　　材料与方法

　　1 动物模型及分组

　　健康大白兔16只(由第三军医大学大坪医院动物实验中心提供)，雌雄不限，体重(2.40±0.20)kg。经兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，将动物固定于兔架上，剪去胸部兔毛，用BIMⅡ型水平式生物撞击机准静态撞击兔右侧胸部，撞击点位于兔右侧第3、4肋间与腋中线交界处，采用准静态撞击，驱动压力为650kPa,撞击面积为4cm2,胸壁压缩3cm,撞击时相为吸气末。随机分为2组：(1)正常对照组(n=8)，不致伤，麻醉后静注生理盐水0.2ml，仅作为测定指标的对照。(2)创伤组(n=8)，致伤后立即耳静脉注射生理盐水1ml/kg，以后1ml/(kg?h)。

　　2 指标测定及方法

　　于伤前和伤后0.5、1、2、4、6小时取血标本进行血浆生化指标的检测。在实验后6小时处死动物收集右肺支气管冲洗液(BALF)，测定肺组织含水量和BALF中的白蛋白含量。肺湿/干重比值=湿重/干重。NE的活力用琼脂扩散法，(弹性蛋白购于美国Emoco公司)，用琼脂中溶解环的直径表示活力，方法见文献[10]。血清α1AT含量的检测采用免疫微量比浊法[11]。血浆和BALF中TNFα、IL8含量用北京邦定公司夹心法ELISA试剂盒测定。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法,组织中的MDA含量用mmol/g组织表示。肺组织MPO的测定，用过氧化氢(H2O2)还原法，以每克组织中的活性表示。

　　3 组织光镜病理学

　　观察大体病理变化，统一取右肺下叶相同部位的组织，10%中性甲醛固定组织，经剃度乙醇脱水，低温石蜡包埋，切片5μm ，HE染色后光镜观察。

　　4 统计学方法

　　各组数据以均数(±s)表示，统计学用Excel 2000 处理数据，组间比较用t检验和方差分析，以P<0.01表示相差非常显著，P<0.05表示相差显著。

　　结果

　　1 血浆NE的活力和α1AT含量的变化(见表1)

　　创伤组NE 0.5小时升高，2～4小时达到高峰，6小时内仍高于正常，与对照组相比有显著差异(P<0.01)。创伤后血浆α1AT的含量先降低，1小时降低至最低且低于伤前和对照组，但无显著差别。此后逐渐升高并高于伤前和对照组水平(P<0.01)，但升高的幅度较NE小。

　　2 撞击前后兔血浆TNFα、IL8含量的变化(见表2)

　　创伤组撞击前和对照组的TNFα含量均较低，撞击后0.5小时开始升高，2小时达到高峰后下降，4～6小时接近对照组水平，创伤组与对照组差异非常显著(P<0.01)，对照组血浆IL8含量较低，创伤组在撞击后0.5～1小时无明显变化，撞击后1小时后开始升高，6小时仍然保持很高水平，创伤组与对照组相比差异明显(P<0.01)。

　　3 肺组织匀浆MDA、MPO、湿/干重比值(W/D)的变化(见表3)

　　创伤组肺组织MDA和MPO的含量较对照组明显升高(P<0.01),W/D也较对照组升高。

　　4 BALF分析(见表4)

　　在BALF，与对照组相比，创伤组白细胞总数和PMN百分比明显增加(P<0.05)，W/D和白蛋白的含量明显升高(P<0.05)，与对照组相比，创伤组IL8　的升高(P<0.01)较TNFα(P<0.05)明显。创伤组NE、α1AT含量与对照组相比显著升高(P<0.01)。

　　表1 血浆NE的活力(mm)、α1AT的含量的变化(略)

　　创伤组伤后与伤前(0时相)比较：*P<0.05，**P<0.01;与对照组比较：△P<0.05,△△P<0.01

　　表2 撞击前后兔血浆TNFα、IL8含量的变化(略)

　　与对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01

　　表3 肺组织MDA、MPO、湿/干重比值(W/D)的变化(略)

　　与对照组比较：△P<0.05，△△P<0.01

　　表4 BALF中炎性指标的变化(略)

　　与对照组比较：△P<0.05,△△P<0.01

　　5 病理学变化

　　大体观察发现，挫伤的肺体积增大、水肿，散在淤血斑块，切片呈红色实样变，光镜观察见肺间质及肺泡腔水肿、渗出、出血、粒细胞浸润，肺泡腔透明膜形成，肺泡结构破坏，肺泡腔内可见大量以中性粒细胞为主的炎细胞浸润，血管内皮白细胞粘附，在非挫伤区肺泡内见充血、水肿、炎细胞浸润等，未见到肺组织的坏死。

　　讨论

　　本实验结果显示，挫伤肺组织NE逐渐释放，之后α1AT的含量先降低后逐渐升高，并高于伤前和对照组水平(P<0.01)，但升高的幅度较NE小。α1AT升高是一种“急性期”反应产物(acute phase protein)[4]。外伤、手术等可使α1AT的分泌增多，这种反应与抑制肺挫伤后发生的炎性反应有关。但同时α1AT分泌可由多种的炎性介质、细胞因子，如肿瘤坏死因子及IL1等的刺激有关,反应的结果使肺组织局部α1AT分泌增加起到保护和治疗ALI的作用[5]。由于NE的活性增高的更多，且α1AT活性中心蛋氨酸残基容易被自由基氧化而失活，而不足以抑制NE的活性增高，减弱了支气管壁和肺泡壁对PMN释放的NE的保护能力。创伤性肺挫伤，直接导致细胞破坏，溶酶体膜崩解大量释放NE，NE自直接的挫伤区进入血循环，引起非挫伤区域的肺组织损伤，但也可能会因为蛋白酶抑制物少量分泌而使NE不至于损伤肺组织，实验早期，即出现蛋白酶与抗蛋白酶的平衡破坏。此外，尽管α1AT的含量在血浆和BALF均升高，但有资料表明其活性应该是降低的[8]，正常血清中NE含量或活性均较低，其活性受如α1AT和a2巨球蛋白所抑制。在血循环中90%的NE与α1AT结合形成复合物而使NE失去活性，增加外源性α1AT转而抑制NE的实验，证明可以抑制内毒素诱导的ALI，说明，在ALI中NE的活性和含量升高，而抗蛋白酶的活性和含量降低，这种蛋白酶-抗蛋白酶的失衡，在ALI的发生机制中有重要的作用[12，13]。

　　TNFα是炎症反应中最早释放，是炎症反应中激活细胞因子产生级联反应的主要介质。TNFα既可以直接影响炎症反应，也可以间接通过PMN激活，释放氧自由基、NE，导致肺损伤[14，15]。本实验显示，创伤早期TNFα的释放有短暂的高峰(1～3小时)，随后急剧降低，与内毒素诱导的ALI有类似的过程。此外，作为PMN的趋化因子，IL8可以促使PMN活化及其随后脱颗粒，释放NE，生成氧自由基,IL8、NE和PMN之间的相互作用形成恶性循环。实验显示创伤后血浆IL8在4～6小时后升高，峰值是继TNFα之后，IL8在创伤后不同的时间出现，持续时间较长，可能与创伤后PMN的持续和过度活化有关，使级联反应增强、扩大[8，9，11]。

　　MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。MPO能够反映PMN的浸润、聚集程度，MPO是PMN浸润的敏感标志[15]。本实验观察到创伤组MPO活性显著升高，肺组织病理学检查发现PMN浸润明显。此外，活化的PMN可释放NE，产生大量氧自由基而破坏肺泡上皮和血管内皮，导致血管通透性增高，肺间质水肿。同时，活化的PMN也可以通过呼吸爆发释放氧自由基，导致细胞活性丧失。尽管特异性的NE抑制剂和外源性α1AT能够抑制或减轻ALI炎症反应，但由于参与ALI的炎症介质和炎症因子种类繁多，机制复杂，单纯用某一种药物，并不能完全抑制炎性反应，同时应用其他药物才能产生更好的效果。

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