大鼠牵张性脊髓损伤动物模型的建立和评价

　　作者：刘雷，裴福兴，杨效宁，李起鸿

　　摘要： 目的 建立大鼠牵张性脊髓损伤的动物模型，探讨大鼠脊髓牵张性损伤的病理生理改变及临床意义。方法 切除大鼠T13-L2双侧椎板，显露脊髓，用特制的脊柱撑开器放置在大鼠T12-L3椎体横突上，纵向牵张，同时用皮层体感诱发电位术中监测。随机分成空白对照组(A组)及实验(B、C、D组);皮层体感诱发电位P1-N1波幅下降30%组(B组)、50%组(C组)和70%组(D)组。观察波幅下降不同程度后，大鼠的神经行为学功能改变，应用HE、尼氏染色，光镜下观察脊髓组织形态结构，采用计算机图像分析系统进行定量分析。结果 随着撑开距离的增加和时间的延长，波幅下降至术前波幅，B组与A组相比，CBS评分，神经元计数、神经元截面积及尼氏体密度的变化无显著差异。光镜下脊髓神经元体积稍小，尼氏体略减少;C组及D组，CBS评分、神经元计数，神经元截面积及尼氏体密度与A组比较有显著性差异(P<0.01)，光镜观察神经元间隙增大，神经元退变，减少、溶解或坏死。尼氏体明显变浅或消失。脊髓结构破坏，出现片状出血灶，大量胶质细胞浸润。结论 大鼠牵张性脊髓损伤动物模型具有可重复性，可定量且模拟临床，该模型的建立为进一步了解牵张性脊髓损伤的发病机理，筛选有效的预防治疗措施奠定了良好的基础。

　　关键词：脊髓损伤;皮层体感诱发电位;大鼠

　　Evaluation and establishment of an animal model of tractive spinal cord injury in rats

　　LIU Lei，PEI Fuxing，YANG Xiaoning，et al.

　　(Department of Orthopaedics,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038，China)

　　Abstract： Objective To establish animal models of tractive spinal cord injury in rats and investigate its pathophysiological changes and clinical significance.Methods T12-L3 spines were tracted longitudinally with a special spinal retractor that was put on proccessus transverses of T12-L3 vertebrae of rat after exposing T13-L2 spinal cord via dual laminectomy,at the same time,spinal cord function was monitored by cortical somatosensory evoked potential(CSEP).Rats were randomly divided into the control group(group A) and experimental groups(B,C,D groups) according to the amplitude of CSEP P1-N1 wave.The amount of decrease of the P1-N1 wave was 30% in group B、50% in group C and 70% in gropu D respectively.After traction,changes of function of neural behavior in rats were observed and morphological structure of spinal cord was analyzed quantitatively with image analysis system of computer.Results With traction of spine,compared with the group A,the group B had no marked difference in CBS score,neuron count,section area of neuron and nissl body density,but the there was a marked difference between C and D groups(P<0.01).Light microscope showed that neuron volume was slightly smaller and nissl body was reduced lightly in group B,neuron space was enlarged and neuron was degenerated,reduced,dissolved or necrotic,nissl body was obviously dissolved,and spinal cord structure was destroyed in the groups of C and D.Conclusion The animal model of tractive spinal cord injury in rats is a reproducible,graded and it mimics clinical picture.The model referred in this article provides a valuable assistance in further understanding etiopathology and screening effective measures of therapy and prophylaxis of this type of injury.

　　Key words:spinal cord injury;cortical somatosensory evoked potential(CSEP);rats

　　牵张性脊髓损伤是脊柱矫形手术的常见并发症之一。随着CD、TSRH等三维矫形器械及诱发电位术中监护的相继应用[1，2]，手术适应证不断扩大，脊柱畸形矫正的效果越来越好。但随之而来的医源性牵张性神经损伤仍然是个严重的问题[3]。而目前对脊髓损伤的治疗效果不佳，预后难以预料，主要是因脊髓损伤后的病理生理机制非常复杂，人们对此认识还不很全面、深入。为了寻求新的、有效的治疗方法，更透彻地阐明脊髓损伤所涉及的复杂机制，更有效地评估脊髓损伤后处理手段的正确性，基于可靠性高、重复性好的脊髓损伤动物模型的研究成为近年来的热点课题。本研究通过动物实验，模仿临床脊柱矫形手术常并发的脊髓牵张性损伤，复制大鼠损伤的动物模型，通过皮层体感诱发电位(CSEP)监测，观察脊髓功能及组织结构改变，从而为进一步对牵张性脊髓损伤的基础及临床研究提供条件。

　　材料与方法

　　1 实验动物及分组

　　40只SpragueDauley成年大鼠，雌雄不限，体重165～250g(由四川大学华西医学中心实验动物中心提供)。根据皮层体感诱发电位(CSEP)P1-N1波幅变化随机分为1个空白对照组和3个实验组(每组10只大鼠)：A组：空白对照组;B组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅30%组;C组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅50%组;D组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅70%组。

　　2 动物模型制备

　　5%水合氯醛以6ml/kg腹腔内注射麻醉大鼠，动物置于25～30℃温度下，腰背部脱毛，俯卧位固定，在放大镜下以T13为中心暴露T12-L3棘突及椎板，用血管钳咬除T13-L2棘突、椎板、黄韧带等。暴露T13-L2相应部位脊髓并保持脊髓完整，将特别的脊髓撑开器固定在T12-L3椎体横突上，每10秒内撑开1mm，间歇5分钟至实验室要求的波幅后持续10分钟。实验组分别于术前、撑开器放置后、撑开器到位时、撑开器取出后10分钟、术后1、6小时等不同时间点分别测量并记录CSEP，测量P1波潜伏期及P1-N1波幅。空白对照组只做手术，安放撑开器，不做撑开，在相应的时间点测量。采用Gale的联合行为学计分方法在大鼠术后24小时盲法测定大鼠的行为学指标。

　　3 CSEP监测

　　在铜网屏蔽室进行，刺激电极置于大鼠左下肢坐骨神经，接收电极置于大鼠冠状缝后2mm、矢状缝旁3mm皮下，参考电极置于后侧颞肌上，接地电极置于大鼠右下肢上段。波宽0.2ms,频率1.9Hz,强度0.4mA,灵敏度5μV/D,高频率波2kHz,低频率波10Hz，叠加次数40～200次。

　　4 神经功能检测

　　应用Gale联合评分[4](CBS)在术后24小时综合评定大鼠脊髓损伤后功能。包括运动、感觉、反射及肢体动作协调等方面。最大值是100分，表示神经功能100%的丧失;最小值0分，表示神经功能完全正常。

　　5 取材及切片制备

　　CSEP监测及CBS评分结束后处死大鼠，以损伤部位为中心取长约1.5cm的脊髓，用4%多聚甲醛固定24小时，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5μm，备用。对照组取相应部位脊髓。

　　6 组织形态学检查

　　从每只大鼠的切片中随机抽取分别做HE、尼氏体染色、光镜观察、神经元计数;每张切片随机选择5个视野，采用美国产Nikon & Spot 图像分析仪测神经元截面积和尼氏体密度。

　　7 统计学处理

　　数值以±s表示，用SPPS10.0软件统计分析，t检验。P<0.05为统计显著性界值。

　　结果

　　1 CSEP变化

　　以各实验组术前P1潜伏期和P1-N1波幅为正常值作自身对照。空白对照组的CSEP在术后有短暂改变。B、C、D组损伤后各时间点的CSEP结果表现为随撑开距离增大潜伏期延长，波幅下降。B组的CSEP潜伏期及波幅在解除牵张后有恢复趋势。C、D组的波幅有缓慢下降趋势，潜伏期有延长趋势(见表1、2)。

　　表1 各组CSEP P1波潜伏期同一时间点上的变化趋势(略)

　　表2 各组CSEP P1-N1波幅同一时间点上的变化趋势(略)

　　2 神经行为学评价结果

　　联合行为评分(CBS)结果见表3。随撑开距离增大，CBS记分越大，正常对照组及B组的CBS记分与C及D组存在显著差异(P<0.01)。

　　3 组织学检查结果

　　3.1 光镜观察 A组灰白质分界清楚，前角神经元胞体大，胞浆丰富，尼氏体清晰可见，核大而圆(图1)。B组灰质神经元间隙增大，脊髓前角个别神经元体积稍小，尼氏体略减少，偶见出血灶。神经纤维形态正常(图2)。C组灰质内神经元间隙及神经纤维间隙明显增大，灰白质内较多出血灶。灰质神经元退变、减少，尼氏体明显变浅，少量胶质细胞浸润(图3)。D组灰白质结构破坏，撕裂，大片出血灶，神经元固缩、坏死、溶解，明显脱失，尼氏体溶解或消失，大量胶质细胞浸润，神经纤维排列紊乱(图4)。神经元计数见表4。 C、D组与A组比较神经元数量明显减少(P<0.01)，B组与A组比较无显著差异。

　　3.2 神经元图像分析 各组神经元截面积和尼氏体密度见表5。C、D组与A组比较有显著性差异(P<0.01)，B组变化不显著。

　　图1 正常脊髓神经元尼氏体清晰可见，核大而圆(Nissl×400)(略)

　　图2 30%牵张组脊髓神经元尼氏体略减少，核正常(Nissl ×400)(略)

　　图3 50%牵张组脊髓神经元数量减少，尼氏体明显浅染，核固缩(Nissl ×400)(略)

　　图4 70%牵张组脊髓神经元溶解核破裂，尼氏体模糊不清或溶解(Nissl ×400)(略)

　　表3 各组CBS评分(略)

　　C、D组与A、B组比较：△：P<0.01

　　表4 各组神经元计数(略)

　　B、C、D组与A组比较:*P>0.05，△P<0.01

　　表5 神经元图像分析(略)

　　B、C、D组与A组比较:*P>0.05，△P<0.01

　　讨论

　　脊髓损伤及其继发性病理生理反应可直接导致神经功能损伤，引起组织器官功能障碍，致残率非常高。对其研究的难题之一就是如何建立一个可以确实模拟实际损伤状况、定量、可重复性的动物模型，使其病理过程能恰如其分地复制到模型动物身上，并能很好地应用于脊髓损伤后治疗的研究。自Allen首次设计了脊髓背侧打击模型以来，各种类型的模型相继出现。Falconer等[2]将大鼠四肢固定，以立体位仪固定头部，从而可上、下、左、右灵活移动以调节脊髓位置。研究中证明，冲力、脊髓压缩程度和速度、传递的能量等因素可以通过与传感器相连的反馈调节回路进行精确调节，能够在最大程度上减少致伤装置系统内的变异因素。Hiruma等[6]将可控皮质撞击装置用来制作脊髓损伤模型，打击面积可以选择不同规格的撞杆(直径1、2、3mm)，速度控制在4.6米/秒，脊髓受压下陷的距离1～3mm，装置致伤的可重复性较高。徐明等[7]使用小颗粒聚乙烯醇固体枪塞剂栓塞椎动脉，复制了急性脊髓缺血损伤模型。这些高选择性能的阻断局部血供制作的缺血性模型尽管制备过程比较复杂，但不影响其他供应区的血流，可控制性及重复性较好。制造动物模型的目的是模拟人类脊髓损伤，并将动物模型上得到的重大发现用于临床。上述的动物模型都有其优缺点，完全理想化的模型是不存在的，各种损伤模型仅能反映临床上该类型脊髓损伤，且各种实验操作，如麻醉、手术制备等不同，也使损伤结果和疗效观察存在很大误差。从损伤机制而言，与临床也存在一定的差异。目前的各种脊髓损伤模型中，仍没有一个完善的适合所有条件的模型，每种模型仅能代表脊髓损伤的某一侧面。而牵张性脊髓损伤作为常见的损伤类型，其发病机制和病理生理变化与以往的各型脊髓损伤有所不同，以上的各种脊髓损伤模型得到的结论不一定能全面解释牵张性脊髓损伤。为此我们根据临床上出现的牵张性脊髓损伤设计本模型，同时模仿术中电生理监测脊髓功能的情况，采用皮层体感诱发电位监测，并根据其波幅变化情况来观察脊髓功能及组织结构改变。

　　研究证明脊髓血流量下降及血管损害是牵张性脊髓损伤早期的病理特征。而CSEP对脊髓缺血性改变非常敏感[8]，CSEP主要反映脊髓后索功能，由于脊髓前后索相邻，又为一体被软脊髓所包饶，故CSEP也以能间接反映前索情况。CSEP可较正确地对脊髓作出功能性诊断和定量分析，并可依据潜伏期延长的多少及波幅降低的程度判断脊髓损伤的严重程度。潜伏期轻度延长，波幅稍降低，提示脊髓受损较轻，反之脊髓受损严重。本实验根据不同牵张组损伤后脊髓功能、病理改变的研究，结果发现：随撑开距离增大，潜伏期延长，波幅下降，说明CSEP波形变化对牵张负荷极其敏感，CSEP的波幅代表了脊髓内神经传导通路电位活动的强弱，反映了传导束和神经元的功能情况。B组在解除牵张有恢复。脊髓神经元间隙稍增大，尼氏体略减少，神经元截面积及尼氏体密度稍下降，脊髓功能出现轻微障碍，说明CSEP波幅下降不超过30%时，其改变是可逆的，这也与以往作者的报道相一致[8]。C、D组则随撑开距离增大，波幅有缓慢下降趋势，脊髓功能明显损害，脊髓灰质内可见大片出血灶，神经细胞固缩、坏死、神经纤维排列紊乱，呈脱髓鞘改变，尼氏体明显减少。神经元截面积及尼氏体密度与A组相比有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。脊髓组织结构完整性产生了不可逆的变化。尤以70%组为甚。

　　研究结果显示：与以往的动物损伤模型相比，通过CSEP波幅变化监测，此模型可定量地控制脊髓损伤，能稳定地获得从轻度到重度不同级别的神经功能损害和组织病理学改变，尽可能地模拟临床状态下牵张性脊髓损伤的发病机理，为研究其病理改变及筛选有效的预防治疗措施奠定了基础。

　　参考文献：

　　[1]Harlbert RJ,Fehlings MG,Moncada Ms.Use of sensoryevoked potentials recorded from the human occiput for intraoperative physiologic monitoring of the spinal cord[J].Spine，1995,20:2318-2327.

　　[2]沈宁江，黄世敏，林庆彪.皮层体感诱发电位(CSEP)监护胸椎及胸椎管手术的临床研究[J].颈腰痛杂志，2002,23(4):286-288.

　　[3]胡勇，胡云，陆骥.脊髓侧凸矫形术中脊髓监护基准的选择[J].中华骨科杂志，2000，20(9):555-558.

　　[4]Gale K,Kerasidis H,Wrathall JR.Spinal cord contusion in the rat behavioral analysis of functional newrologic impairment[J].Exp Neurol,1985,88(1):123-134.

　　[5]Falconer JC,Narayana PA,Bhattachariee M,et al.Characterization of an experimental spinal cord injury model using waveform and morphometric analysis[J].Spine,1996，21(1):104-112.

　　[6]Hiruma S,Otsuka K,Satou T,et al.Simple and reproducible model of rat spinal cord injury induced by a controlled cortical impact device[J].Neurol Res,1999，21(3):313-323.

　　[7]徐明，杨惠林，倪才方，等.经椎间动脉栓塞法建立急性脊髓损伤模型[J].中华创伤杂志，2000，16(2):88-90.

　　[8]宋跃明，毛方敏，罗祖明，等.兔牵张性脊髓损伤的病理形态学改变[J].中华骨科杂志，1997，17(5)：304-306.

　　(第三军医大学西南医院骨科，重庆 400038;四川大学华西医院骨科 ，四川 成都 610041)