大鼠高位脊髓损伤并创伤失血休克后急性期神经内分泌变化对器官血流量的影响

　　作者：刘育杰，沈岳，王爱民 作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心骨创伤科，重庆 400042

　　【摘要】 目的 研究大鼠高位脊髓损伤并创伤失血休克后急性期器官血流量及血清去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、神经肽Y(NPY)浓度变化规律。方法 实验1：将27只SD大鼠随机分为假手术组(A组，7只)、创伤失血组(B组，胫骨骨折并失血，10只)、多发伤组(C组，高位脊髓损伤合并胫骨骨折及失血，10只)，B、C组伤后平均动脉压(MAP)维持在40mmHg并记录总失血量。利用彩色微球技术检测伤后器官血流量变化并计算总外周血管阻力(TPR)和心排出量(CO)。实验2：另取SD大鼠复制B、C组模型(每组10只)，于伤后不同时间点抽取动脉血，利用酶联免疫吸附法测定血清NE、E浓度，放射免疫法测定NPY浓度。结果 C组血压降至40mmHg总失血量显著低于B组(P<0.01)。B组伤后1小时，心、脑血流量降幅显著低于其它器官(P<0.01)，器官血流量出现重新分布。TPR在伤后1小时显著增加，随后显著降低。伤后各时间点CO均显著降低，血清NE、E、NPY显著增高(P<0.01)。C组伤后1、3、6小时各器官血流量均显著降低(未出现重新分布)，CO、TPR均显著下降，血清NE、E、NPY轻度增高。结论 大鼠高位脊髓损伤并创伤失血伤后急性期，各器官血流量未出现重新分布。血清NE、E、NPY相对不足可能是其原因之一。

　　【关键词】 脊髓损伤 失血性休克 血流量 多发伤

　　Effects of neuroendocrine on organ regional blood flow in traumatic hemorrhagic shock rats combined with spinal cord injury during acute stage

　　LIU Yujie,SHEN Yue,WANG Aimin

　　Department of Orthopedic and Traumatic Surgery，Center for War Wound and Trauma of PLA，Institute of Surgery Research，Daping Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400042，China

　　Abstract： Objective To investigate changes of organ regional blood flow(RBF) in traumatic hemorrhagic shock rats combined with spinal cord injury in vivo and the serum norepinephrine (NE),epinephrine (E) and neuropeptide Y(NPY) concentration during acute stage.Methods Twentyseven SD rats were divided into 3 groups in the first part of experiments: shamoperation (Group A),animals combined with hemorrhage and tibia fracture (Group B) and animals combined with spinal cord injury,hemorrhage and tibia fracture (Group C).The MAP of Group B and C were maintained at 40mmHg after trauma and total volume of lost blood were recorded.The RBF of the organs was monitored by colorlabeled microspheres technique after trauma,and total peripheral resistance (TPR) rise and cardiac output (CO) were calculated.In the second part,twenty SD rats were randomly divided to 2 groups using the same injury as that found in Group B,C to measure the concentration of serum NE,E(ELISA assay),NPY(radioimmunity assay)after trauma.Results The total volume of lost blood in group B was significantly higher than group C(P<0.01) to maintain MAP at 40 mmHg.RBF of heart and brain showed a slight drop while other organs dropped dramatically at 1 h after trauma.RBF exhibited redistribution.TPR increased at 1 h and dropped at 6 h after trauma.CO dropped dramatically,and serum NE,E,NPY increased dramatically after trauma(P<0.05) in group B.However,RBF,TPR and CO in Group C dropped uniformly and serum NE,E,NPY concentration increased slightly after trauma(P<0.05).Conclusion The organ RBF in traumatic hemorrhagic shock rats combined with spinal cord injury do not exhibit redistribution as compared with rats of traumatic hemorrhagic shock early after trauma.That phenomenon could be partly due to the relative shortage of serum NE,E,NPY after trauma.

　　Key words:spinal cord injury;hemorrhagic shock;blood flow;multiple trauma

　　脊柱脊髓型严重多发伤是以脊柱脊髓损伤为主要创伤之一的严重多发伤，是致残率、死亡率最高的一类严重多发伤[1]。本研究在大鼠高位脊髓损伤并创伤失血休克模型基础上，利用彩色微球技术观察了此类创伤急性期重要脏器血流量变化，并和创伤失血性休克大鼠进行对比，以进一步明确此类损伤伤后急性期脏器灌流特点，为今后脊柱脊髓型严重多发伤的相关研究奠定基础。

　　材料与方法

　　1 实验动物分组及模型制作

　　SD大鼠47只,体重220～250g,雌雄各半(重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所医学实验动物中心提供。实验1：取27只大鼠，按照数字随机法将大鼠随机分为假手术组(A组，7只)、创伤失血休克组(B组，胫骨骨折并失血，10只)、多发伤组(C组，高位脊髓损伤合并胫骨骨折及失血，10只);实验2：取20只大鼠，按同样的方法复制上述B、C两组动物模型，每组10只。

　　大鼠在实验前12小时禁食、自由饮水。实验当日用质量分数25% 氨基甲酸乙酯(1 g/kg) 和1%的氯醛糖(50 mg/kg) 混合液腹腔注射麻醉。麻醉后，左侧股动脉插管通过三通连接压力传感器采用八道生理记录仪监测平均动脉压(MAP)和放血，右颈总动脉插管至左心室，浓肝素(500 U/kg)冲管，防止导管堵塞。术毕，大鼠稳定15 分钟，各组处理如下：

　　(1)A组：切开项背部皮肤、软组织、肌肉，咬除椎板显露脊髓，其余不做任何处理;(2)B组：钳断右侧胫骨制成闭合性胫骨骨折，继而于10 分钟内缓慢从股动脉中放血，使得MAP降低至40mmHg(1mmHg=0.133kPa)并维持;(3)C组：无菌条件下切开大鼠项背部皮肤，钝性分离皮下组织、肌肉，暴露C7、T1棘突和椎板，用特制蚊式钳咬除C7、T1椎板以暴露脊髓。稳定10分钟后，用夹力为98g动脉瘤夹夹压脊髓1分钟致完全性脊髓损伤，术毕逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤。脊髓损伤同时，钳断右侧胫骨，稳定10分钟后，开始缓慢放血，于10分钟内缓慢从股动脉中放血，使得MAP降至40mmHg并维持。实验结束后记录B、C两组大鼠总失血量[2]。

　　2 主要试剂、仪器

　　彩色微球(Dyerak Microspheres，美国Triton Technology公司)，包括蓝色(Blue)、黄色(yellow)、橘红色(orange)、红色(persimmon)、柠檬色(lemon)5种颜色。全波长酶标仪1500型(Multiskan Spectrum，芬兰Thermo Labsystems公司)。八道生理记录仪(澳大利亚AD Instrument公司)。吐温80、氢氧化钾、37%盐酸、乙氧乙酸乙酯均由重庆化学试剂总厂生产。去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、肾上腺素(epinephrine，E)ELISA测定试剂盒均购于美国B&D公司，神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)放免试剂盒购于北京华英生物技术研究所。

　　3 器官血流量、总外周血管阻力(TPR)、心输出量的测定(CO)

　　参照Shimizu[3]和赵松等[4]的方法并做适当调整。将0.3 ml彩色微球溶液(内含15万个彩色微球，用体积分数0.05% 吐温80-生理盐水溶液稀释)分别按黄色、红色、橘红色、柠檬色的先后顺序于伤前、伤后1、3、6小时快速注入左心室，每次注射1种颜色的微球。注射后立即用0.3 ml的0.05%吐温80-生理盐水溶液冲管。在此操作前10秒，从左股动脉导管以0.7 ml/min恒速抽取参照血液样本，持续80秒。

　　实验结束后过量麻醉处死动物，取肝(肝中叶)、左肾、右肾、空肠(近胃端，取15cm长)、脑、心，生理盐水冲洗残血，吸干水分后精确称重。通过强碱溶解，反复离心、清洗后，最后回收到干燥的微球。使用酸化乙氧乙酸乙酯200μl萃取微球表面的染料，通过全波长酶标仪读取各萃取剂溶液在670、545、495、450、390nm波长下的吸光度，将所得实验数据输入Triton Technology公司提供的软件，按照下列公式计算出各器官局部血流量(regional blood flow, RBF)、TPR、CO。

　　计算方法：

　　器官局部血流量(ml·min-1·g-1)=参照样本血流量(ml)×组织样本内微球数参照样本微球数×组织样本重量(g);

　　心输出量(ml·min-1·100g-1)=注射总微球数×参照样本血流量(ml/min)参照样本微球数×体重(g)×100

　　外周血管阻力(mmHg·ml-1·min·100g)=MAPCO

　　RBF降低百分比(%)=正常RBF-伤后RBF正常RBF×100%

　　4 血清NE、E、NPY浓度的测定

　　分别在伤前、伤后1、3、6小时抽取动脉血0.8ml(抽血完毕后迅速补充等量的乳酸林格氏液)，血液自然凝固后，1500g离心15分钟，分离血清。用ELISA法测定血清NE、E浓度，放免法测定血清NPY浓度。严格按试剂盒说明书加入相应试剂及测定。

　　5 统计学处理

　　采用SPSS10. 0统计程序进行统计学分析。两组间均数比较采用独立样本t检验，组内前后比较采用配对t检验，多组均数比较则采用单因素方差分析(ANOVA)。器官血流量降低百分率间的比较用χ2检验。实验数据以均数±标准差(±s)表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。 结 果

　　1 伤后各器官血流量变化

　　实验测得微球回收率在70%～95%间，符合实验要求。A组各器官血流量变化在手术前后各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。左右肾血流量基本一致，差异无统计学意义(P>0.05)。B组血压降至40mmHg需要放血(6.2±1.2)ml，而C组则需要放血(2.3±0.5)ml，两组差异存在显著统计学意义(P<0.01)。

　　B组伤后1小时，除大脑外所有脏器血流量均显著下降(与A组及伤前比，后同，P<0.01)。从降幅看，与伤前对比，大脑和心脏分别下降了(2.8±0.8)%和(25.7±10.0)%，均显著低于其它器官(P<0.01)。伤后3小时及6小时，各器官血流量均显著下降(P<0.01)，其中降幅最大的是空肠。C组休克1小时后，各器官血流量均显著下降，下降幅度均为伤前30%～40%。伤后3、6 小时，各器官血流量继续下降(P<0.01)，但与B组比差异不大(P>0.05)。见表1。

　　2 伤后各组TPR、CO变化

　　A组手术前后CO和TPR差异无统计学意义(P>0.05)。B组伤后1小时，TPR显著增高(P<0.01)，至伤后6小时，TPR显著降低(P<0.05)。伤后1小时，CO即显著下降(P<0.01)，伤后3、6 小时，CO轻度回升，但依然低于伤前及A组相应时间点(P<0.05或0.01)。C组伤后1、3、6 小时，TPR、CO均显著下降(P<0.01)。见表1。表1 伤后不同时间点RBF(ml·min11·g-1)、CO(ml·min-1·100g-1)、TPR(mmHg·ml-1·min·100g)及RBF降低百分比(%)改变(略)

　　3 血清NE、E、NPY变化

　　虽然显露脊髓的手术对血浆NE、E、NPY均有轻微影响，但和伤前对比差异无统计学意义(P>0.05)。B组伤后1小时血清NE、E和NPY浓度均快速增高并长时间维持于高值(与伤前比，P<0.05或0.01)。C组血清NE、E、NPY浓度在伤后1、3、6 小时轻度高于伤前(P<0.05)，但显著低于B组(P<0.01)。见图1～3。

　　讨 论

　　本研究采用的是笔者建立的“大鼠高位脊髓损伤并创伤失血休克模型”。此模型能较好的模拟脊柱脊髓型多发伤伤后急性期临床病理生理学特征，还具有重复性好、简便易行等特点[2]。

　　彩色微球技术是将一些特定的颜色染于塑料微球的表面，染料在血液中并不会褪色，只有通过特定萃取剂才能退去其表面的染料，故可注入心脏，使其随血液循环到达全身，通过分析萃取颜色深浅定量微球数目从而检测器官血流量。由于能同时检测多器官血流量，也能进行多时相点连续检测，具有微创、经济、环保、准确性高等优点，目前在测定组织器官血流量方面有取代超声多普勒和放射微球的趋势[3，5]。本研究中伤前各组器官血流量与文献报告[3，5]接近，双侧对称器官(肾脏)血流量基本一致，提示彩色微球在血液循环中分布均匀，利用彩色微球法测定RBF具有较强的可靠性。

　　本研究发现：虽然休克程度均为40mmHg，创伤失血性休克后1小时，各器官血流量出现重新分布现象(肾、肝、肠等内脏器官血流量大幅降低，但心、脑降幅较小)，TPR显著增加，血清NE、E、NPY浓度急剧增高并长时间维持在高水平。而高位脊髓损伤并创伤失血休克后1小时，各器官血流量一致性的降低，未出现器官血流量的重新分布，TPR和CO在伤后各时间点均显著降低，血清NE、E、NPY浓度只出现轻度增高。

　　大鼠单纯失血性休克后代偿期，脏器血流量出现重新分布。本研究也发现，B组伤后同样出现脏器血流量重新分布的现象。这是因为在休克早期(伤后1小时)，在脊髓功能完整情况下，骨折、失血使得交感神经系统被激活，交感神经末梢分泌的NE、E、NPY大幅增高。一方面，缩血管物质作用与外周阻力血管使其强烈收缩，表现为TPR显著增高;另外，由于各内脏肾上腺素能受体亚型分布的不均一，导致脏器血流量重新分布，以最大限度的保证重要脏器(心、脑)血液灌注。休克晚期(伤后3、6 小时)虽然缩血管物质浓度依然较高，但此时已进入循环衰竭期，心、血管对缩血管反应性均显著下降，导致RBF、TPR显著下降[6-8]。

　　有研究证明，大鼠单纯脊髓损伤后血清NE、E和正常值相比不会出现明显波动[9]。本研究发现，脊髓损伤情况下，失血和骨折虽能使大鼠血清NE、E浓度轻度增高(C组)，但远远低于B组，提示交感张力相对较低，对失血和骨折等伤害性刺激产生应答强度不足，缩血管物质产生相对较少，不能满足保持血流动力学稳定的需要，表现为一种“相对缺乏”的状态。

　　当多发伤中合并有脊髓损伤后，自主神经系统功能严重紊乱(包括交感神经张力下降或消失、迷走张力神经增强，交感神经迷走神经张力平衡紊乱)[10]。此时，一方面，由于交感神经张力降低，由交感神经张力维持的外周阻力血管出现广泛的扩张，因而TPR显著下降;同时，交感神经末梢分泌的缩血管物质“相对缺乏”，机体正常代偿功能丧失或降低，导致内脏器官血流量未出现代偿性的重新分布，机体重要脏器很快进入衰竭状态。

　　因此，脊髓功能的完整性是器官血流量重新分布、机体发挥正常心血管代偿功能的必要条件。血清NE、E、NPY的“相对缺乏”可能是导致各器官血流量未出现重新分布的直接原因之一。

　　由于脊柱脊髓型多发伤伤后脊髓功能紊乱使得机体代偿不良，这可能是此类损伤伤后急性期发生血流动力学紊乱、脏器衰竭和高死亡率的主要原因之一。脊柱脊髓型多发伤伤后急性期血流动力学变化及器官血流量变化规律均提示这是一种较为特殊的休克状态，应引起临床医生的重视。至于在救治方面是否存在特殊性，还需要更进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]刘思海，王爱民，孙红振，等.损伤严重度评分在脊柱脊髓型严重多发伤救治中的应用[J].创伤外科杂志,2006,8(3):209-211.

　　[2]刘育杰，沈岳，王爱民.一种大鼠脊柱脊髓型严重多发伤模型的建立[J].中华创伤杂志，2007，23(10)：1-5.

　　[3]Shimizu T,Choudhry MA,Szalay L,et al.Salutary effects of androstenediol on cardiac function and splanchnic perfusion after traumahemorrhage[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2004,287(2):R386-390.

　　[4]赵松，张连阳，李勇，等.肝撞击伤后腹腔镜二氧化碳气腹对胃血流量影响的实验研究[J].创伤外科杂志,2007,9(3)：199-201.

　　[5]Hakkinen JP,Miller MW,Smith AH,et al.Measurement of organ blood flow with coloured microspheres in the rat[J].Cardiovasc Res,1995,29(1):74-79.

　　[6]Wang P,Ba ZF,Burkhardt J,et al.Traumahemorrhage and resuscitation in the mouse: effects on cardiac output and organ blood flow[J].Am J Physiol,1993,264(4):H1166-1173.

　　[7]文亮,毕敏,刘明华.失血性休克期间器官血流量的变化[J].临床麻醉学杂志,1996,12(6):297-298.

　　[8]赵克森.重症难治性休克发生机制的若干进展[J].解放军医学杂志,2005,30(7):552-555.

　　[9]刘育杰，沈岳，王爱民.高位脊髓损伤后早期心血管病理生理改变[J].中国脊柱脊髓杂志，2007，17(5):391-394.

　　[10]Gondim FA,Lopes AC Jr,Oliveira GR,et al.Cardiovascular control after spinal cord injury[J].Curr Vasc Pharmacol,2004，2(1):71-79.