兔严重烫伤早期血脑屏障改变的动态研究

　　作者：胡俊，黎海涛，丁仕义，程绍钧，李前伟，张广运，廖顺明，张恩全 (第三军医大学西南医院放射科，重庆 400038;解放军第5医院放射科，宁夏银川 740005;第三军医大学西南医院核医学科，重庆 400038)

　　摘要:目的 探讨兔严重烫伤(50%Ⅲ度)早期血脑屏障开放的最早时间、部位及特征。 方法 雄性大白兔42只，随机分成6组(对照组、烫伤后1、2、2.5、3、4小时组)，烫伤组均制成50%Ⅲ度烫伤模型。采用125 I标记的牛血清白蛋白(125 I-BSA)作为示踪剂，并与各组电镜结果进行对比观察。 结果 125 I-BSA的在体实验证实，烫伤后2.5小时双侧前叶、小脑的比放射性较对照组有显著性增加。电镜结果表明烫伤后2小时，双侧小脑、前叶皮质部分毛细血管周围出现水肿。 结论 兔50%Ⅲ度烫伤后2小时，双侧前叶和小脑处血脑屏障出现开放;烫伤后3～4小时，脑组织出现弥漫性血脑屏障开放。125 I-BSA测定微血管通透性灵敏度高，可精确地定量分析，全面、确切地反映早期血脑屏障的病理变化。

　　关键词: 严重烫伤;血脑屏障; 125 I标记的牛血清白蛋白(125 I-BSA);兔

　　Dynamic research of the opening of blood-brain barrier in the early stage of severely scalded rabbits

　　HU Jun，LI Hai-tao，DING Shi-yi，et al.

　　(Department of Radiology，Southwestern Hospital，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China)

　　Abstract: Objective To explore the earliest time，position and characteristics of the opening BBB in the early stages of severely scalded rabbits.Methods Forty-two rabbits were randomized into control、1、2、2.5、3and4h groups after scald injury.The rabbits in wounded groups were inflicted with50%TBSA ofⅢdegree skin scald.125 I labeled bo-vine serum albumin(125 I-BSA)was used as tracer to observe the earliest time point and position of opening of BBB after severe scald.The results were compared with the changes of ultrastructure by electronic microscopic.Results 125 I-BSA intake began to increase remarkably at2.5hour in anterior cortex and cerebellum，and it became increase remarkably at3hour in all parts of the brain.Histological changes of BBB were observed as early as2hour after scald，accompanied by swelling of basal lamina and glial cell.The tight junction of blood vessel endothelial cell began to loose and became vague at3hour after scald.Conclusion The earliest opening of BBB is at2hour after scald，and the position is at cerebellum and anterior cortex.These facts suggest that the impairment of BBB would aggravate in a diffuse and progressive way.125 I-BSA is sensitive and precise to monitor the permeability of BBB.

　　Key words:severe scald;blood-brain barrier;125 I-BSA;rabbits

　　血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是机体维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础，在创伤性脑水肿的形成过程中起着重要作用[1] 。研究发现严重烫伤早期，血脑屏障损害，通透性增加，持续性发展将最终导致脑水肿的发生。本实验采用125 I标记的牛血清白蛋白(125 I-BSA)作为示踪剂，在兔50%Ⅲ度烫伤模型上，于不同时相点检测渗入脑组织中125 I-BSA的含量，并相应地取电镜标本行对比观察，对兔严重烫伤早期血脑屏障的功能变化进行定性和定量分析，以探讨严重烫伤后血脑屏障开放的最早时间、部位及其特征。

　　材料与方法

　　1 材料

　　健康雄性新西兰大白兔42只，体重(3±0.5)kg，由第三军医大学实验动物中心提供。采用随机分段法分成6组(7只.组):对照组(烫伤前)、烫伤后1、2、2.5、3、4小时，烫伤组均制成50%Ⅲ度烫伤。从每组中随机取6只兔，注射125 I-BSA进行观察，另1只兔放血活杀后取脑组织，进行电镜观察。

　　2 严重烫伤模型的制备

　　采用我校全军烧伤实验所建立的致伤方法[2] 。计算兔体表面积，计算公式为:S(体表面积)=10×W 2.3 ，W为兔的体重。用10g.L戊巴比妥钠(30mg.kg)溶液经耳缘静脉注射作全身麻醉，剪去相当于总体表面积50%的颈部、背部、肋腹侧部长毛，用8%硫化钠温溶液浸湿脱毛，将欲致伤皮肤浸入92～94℃水中30秒，以建立50%Ⅲ度烫伤模型(皮肤烫伤程度经病理组织学证实)。伤后不作任何处理。

　　3 125 I-BSA的注射及标本采集

　　采用Iodogen法[3，4] 进行蛋白质的碘化标记，先用Iodogen涂管，然后加入磷酸缓冲液(PB)、牛血清白蛋白(BSA)、Na125 I等进行碘化反应。烫伤前经耳缘静脉每只兔按0.5ml.kg注入125 I-BSA，各时相点通过股动脉放血活杀后取脑，取双侧前叶、颞叶、后叶皮质、小脑、脑干、基底节区脑组织，将标本用电子天平(德国Sartorius，d=0.1mg)精确称其湿重后投入中号试管中，在GC-911γ放射计数器上测定各组织每分钟的放射性计数(cpm)，计算各部位的比放射性(cpm.g)。

　　4 电镜标本采集及观察

　　在深麻醉状态下，于各时相点切断兔一侧股动脉，放血活杀，用骨科钻钻开颅骨至硬膜外剪开硬脑膜，分别采集与125 I-BSA标本检测相同部位的1mm 3大小脑组织，浸泡入2ml的3%戊二醛内，4℃冰箱内固定6小时，常规丙酮逐级脱水、包埋、切片、染色。电子显微镜下观察血脑屏障的超微结构变化。

　　5 统计学方法

　　数据用均数±标准差(ˉx±s)表示，采用SPSS10.0统计软件，行单因素方差分析。

　　结果

　　1 125 I-BSA的测量结果

　　实验结果显示:各部位烫伤前、烫伤后不同时相点比放射性计数有明显差异。经过多重比较发现烫伤前、烫伤后1、2小时各部位的比放射性计数无明显差异，烫伤后2.5小时示双侧前叶、小脑的比放射性计数较烫伤前有显著的增加，其它部位改变不明显。烫伤后3小时，各部位的比放射性计数较烫伤前均有显著的增加，伤后4小时比放射性计数持续增加。烫伤前后各时相点不同部位的比放射性计数结果见附表。

　　附表 烫伤前后不同时相点各部位脑组织比放射性计数(略)

　　与伤前比较:* P<0.05，** P<0.01

　　2 电镜观察

　　对照组:脑内毛细血管内皮细胞完整，吞饮小泡(pinocytotic vesicles)很少。内皮细胞之间以紧密连接或闭合小带形式连接成无间隙存在的整体。内皮细胞之外有基膜(厚约20nm)，与内皮细胞和胶质膜(glial membrane)紧密相连。毛细血管表面积的绝大部分被星形细胞末足(end feet)构成的胶质膜覆盖。

　　烫伤后1小时:血管内皮细胞紧密连接完整，内皮细胞内各细胞器变化不明显。

　　烫伤后2小时:双侧小脑、前叶皮质部分血管周围水肿，血管内皮细胞紧密连接尚完整，部分基膜和胶质细胞足突稍肿胀。内皮细胞和胶质细胞周围水肿，其内线粒体肿胀，少数线粒体嵴发生空泡变(见图1)。

　　烫伤后2.5小时:脑组织各部位血管周围水肿加重，神经细胞周围也出现水肿。血管内皮细胞、基膜和胶质细胞足突部分肿胀。内皮细胞和胶质细胞内有较多线粒体嵴发生肿胀。

　　烫伤后3小时:血管内皮细胞紧密连接增宽、稍模糊。内皮细胞和胶质细胞内线粒体肿胀更加明显，较多线粒体嵴发生空泡变、断裂，吞饮小泡增多(见图2)。

　　烫伤后4小时:脑组织各部位血管周围水肿进一步加重，甚至血管周围出现液化灶，血管内皮细胞紧密连接模糊、甚至消失，细胞肿胀更加明显(见图3)。

　　图1 50%Ⅲ度烫伤后2小时右侧小脑示:血管周围水肿，内皮细胞线粒体肿胀，吞饮小泡增加。胶质主板线粒体肿胀。(TEM×4000) (略)

　　图2 50%Ⅲ度烫伤后3小时左侧前叶示:血管周围肿胀，血管基膜模糊。(TEM×4000)(略)

　　图3 50%Ⅲ度烫伤后4小时右侧小脑内皮细胞连接模糊，周围水肿。(TEM×8000)(略)

　　讨论

　　1 兔50%Ⅲ度烫伤后血脑屏障最早开放时间、部位和表现特点

　　血脑屏障是维持机体中枢神经系统内环境稳定的结构基础。它由中枢神经系统的毛细血管内皮细胞之间的紧密连接、基底膜以及毛细血管周围的胶质细胞突起构成。其功能与结构的正常主要靠毛细血管内皮细胞间紧密连接结构的完整来维持[5] 。

　　本实验电镜观察提示:兔50%Ⅲ度烫伤后2小时，血脑屏障结构即出现开放，但部位局限且开放程度轻，主要为双侧小脑、前叶皮质部分毛细血管周围水肿，血管内皮细胞紧密连接尚完整，主要为毛细血管通透性的改变;烫伤后3小时，开放程度加重，脑组织各部位血管内皮细胞紧密连接稍模糊;烫伤后4小时，细胞肿胀更加明显，血管内皮细胞紧密连接模糊、甚至消失。

　　125 I-BSA的在体分布实验也证实了在烫伤后早期血脑屏障的这种改变。

　　电镜可以直接、准确地反应血脑屏障超微结构的组织学改变，是血脑屏障开放的最直接的证据。兔50%Ⅲ度烫伤后血脑屏障最早开放时间是烫伤后2小时，烫伤后3～4小时各部位血脑屏障均出现开放。已有的研究证实50%Ⅲ度烧伤后6小时，犬脑 内已出现早期脑水肿的组织学改变[6，7] 。严重烧伤后，缺氧、内毒素、酸中毒等多种因素影响血脑屏障的结构和功能，其通透性呈渐进性增加。随病变时间的延长，血脑屏障损伤程度逐渐加重，开放程度不断增加，最终表现为弥漫性的血脑屏障开放，以致脑水肿的形成[8，9] 。

　　2 125 I-BSA在动态观察严重烫伤早期血脑屏障开放中的应用

　　利用放射性核素或其标记物作为示踪剂(Tracer agent)，通过检测示踪剂在体内或体外的位置、数量和变化，可进行物质的动态定量分析和定位[10，11] 。

　　125 I是一种最常用的标记蛋白质和多肽的放射性同位素[12] 。本实验采用125 I-BSA作为示踪剂，采用Iodogen法标记蛋白质。Iodogen法标记对蛋白质损伤小，操作步骤简单，标记重复性好，可获得高比活度和高活性的125 I标记蛋白[13] 。

　　125 I-BSA在实验动物体内对血脑屏障开放处具有一定的导向定位作用，可以在开放血脑屏障的部位特异性浓聚，积聚量和血脑屏障开放程度成正相关[14] 。我们观察到125 I-BSA在烫伤前脑组织各部位比放射性无显著性差异，提示125 I-BSA作为血管示踪物可以通过单向被动扩散的方式，透过正常血脑屏障，均匀分布于脑组织内，并可以长时间内滞留于脑内。兔50%Ⅲ度烫伤后2小时，各部位组织比放射性和烫伤前相比无显著性改变(P>0.05)，烫伤后3小时各部位组织比放射性和烫伤前相比均有显著性增加(P<0.05)。为了更好地了解兔50%Ⅲ度烫伤后血脑屏障改变情况，我们增加了2.5小时组。发现烫伤后2.5小时双侧前叶、小脑处组织比放射性和其它部位相比有显著性增加(P<0.05)。说明烫伤后2.5小时双侧前叶、小脑处血脑屏障开放，125 I-BSA有特异性浓聚，但范围较小;随着烫伤后时间的延长，于烫伤后3小时血脑屏障开放的范围继续扩大，开放的程度加剧，脑组织各部位血脑屏障均出现开放，各部位脑组织都出现125 I-BSA特异性浓聚，而且积聚量进一步增加。

　　125 I-BSA测定兔50%Ⅲ度烫伤后血脑屏障开放的最早时间、最早开放的部位与电镜观察结果基本一致，因此利用125 I-BSA测定微血管通透性，方法简便、测量简单，灵敏度高且能精确地定量[15] 。

　　参考文献:

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　　[15] Xi G，Keep RF，Hoff JT.Pathophysiology of brain edema for-mation[J].Neurosurg Clin N Am，2002，13(3):371-383.