去铁敏对损伤脊髓一氧化氮合酶表达的影响

　　作者：梁朝革，陶琨，佐雪梅，王奕 作者单位：1.上海长宁区医院骨科，上海200336;2.上海长宁区医院病理科,上海200336;3.上海长宁区医院检验科,上海200336

　　【摘要】 目的研究去铁敏(DFO)对急性脊髓损伤大鼠的神经功能保护作用及对3种一氧化氮合酶(NOS)亚型表达的影响。方法利用Allen's打击模型，致伤力为25gcf(10g×2.5cm)，选用SD大鼠36只，随机分为3组(n=12)：空白组(C组);脊髓损伤组(生理盐水组,S组);去铁敏治疗组(DFO组)。分别于伤后4小时取材，免疫组化方法检测3种NOS亚型的表达情况，并于伤后5周行BBB评分。结果DFO组及S组伤后上述指标比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论去铁敏通过阻断铁离子引发的脊髓组织脂质过氧化反应而减轻脊髓组织的炎症反应，减少诱导型NOS(iNOS)的表达;并通过减轻脊髓组织细胞内钙超载，降低固有型NOS(cNOS)的活性，减少了脊髓组织的继发损伤程度。

　　【关键词】 脊髓损伤;去铁敏;一氧化氮合酶;脂质过氧化反应

　　Protective effect of desferrioxamine on the NOS expression after SCI in rat

　　LIANG Chaoge，TAO Kun，ZUO Xuemei，et al.

　　Department of Orthopaedics,Shanghai Changning Center District Hospital,Shanghai200336，China

　　Abstract：ObjectiveThe aim of this study is to assess the neuroprotective effect of desferrioxamine and the effect of which on the 3 NOS in secondary lesion after SCI in rat.MthodsContusion model of SCI using the modified Allen's method that resulted in rats with incomplete paraplegia was used.Thirtysix rats were divided into three groups(n=12): control group(C group),SCI group(S group),desferrioxamine group(DFO group).Four hours after trauma,activity of iNOS,nNOS and eNOS had been measured using immunohistochemistry methods in the lesion of spinal cord.The functional status was assessed using BassoBeattieBresnehan(BBB) locomotor rating scale in the fifth week(C group).ResultsThere were significant differences in the activity of iNOS,nNOS,the functional status between C group and the other 2 groups,and there were significant differences in eNOS between S group and C group.There were significant differences in the factors abovementioned between DFO group and S group.ConclusionThe neuroprotective effect of DFO is that DFO can reduce the expression of 3 NOS by inhibiting lipid peroxidation,inflammatory reaction and calcium overload. New therapeutic strategies for SL prevention, based on the modulation of 3NOS, will be evaluated.

　　Key words:spinal cord injury;desferrioxamine;NOS;lipid peroxidation

　　脊髓损伤后，多种因素参与了脊髓的继发损伤过程。研究显示[1]，脊髓损伤后游离铁浓度迅速升高，触发脂质过氧化反应。同时，脊髓损伤后，由于局部缺血、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸积聚及细胞去极化，致钙离子大量向细胞内流动，可使一氧化氮合酶(NOS)活性增高使局部一氧化氮(NO)产生增多，加重脊髓组织的继发损伤。本研究通过建立大鼠脊髓损伤打击模型，观察去铁敏对损伤后脊髓组织中3种NOS活性的影响，及其对脊髓组织的保护作用。

　　材料与方法

　　1实验动物分组与试剂

　　健康封闭群SD大鼠36只(复旦大学实验动物中心提供)，体重(260±30)g，随机分为3组(n=12)：空白组(C组)，行椎板切除不损伤脊髓;去铁敏治疗组(DFO组)，损伤后15分钟腹腔注射30mg/kg;对照组(SAL，S组)，损伤后注射等量的生理盐水。去铁敏购于诺华制药公司，3种NOS试剂购于武汉博士德公司。

　　2大鼠脊髓损伤模型制备

　　按改良Allen's撞击法[2]制作大鼠脊髓不完全损伤模型。大鼠称重后，用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉，俯卧位固定，背部剪毛，10%活力碘消毒，铺洞巾，以T10棘突为中心取背部正中切口(约5cm)，显露T6~12棘突及椎板。用特制手术钳咬除相应节段棘突及全椎板，以脊髓为中心显露直径约2.8mm圆形区，在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片，用直径12.4mm、重10g的圆柱状金属棒在细玻璃管的引导下从2.5cm高处垂直落下，打击垫片致脊髓急性挫伤，致伤力为25gcf(10g×2.5cm)，脊髓损伤成功后逐层缝合切口。术后以恒温电毯保持肛温(37±0.5) ℃，精心饲养，不限饮水及进食，人工膀胱排尿3次/d，直至恢复排尿功能。对照组仅行椎板切除，不损伤脊髓。损伤后4小时各组取6只处死，多聚甲醛灌注，石蜡包埋行免疫组化检查;其余6只于损伤后5周行BBB评分。

　　3指标测定

　　3.1免疫组化免疫组化染色：将蜡块连续切片(厚度为7μm)，脱蜡、水化组织切片，CD117热修复，蒸馏水漂洗，置于Tris缓冲生理盐水(TBS)中，滴加3%过氧化氢(H2O2)阻断内源性过氧化物酶，孵育10分钟，蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟。一抗孵育30分钟，TBS漂洗10分钟，EnVision二步法二抗孵育30分钟，TBS漂洗10分钟，底物溶液3，3’二氨基联苯胺(DAB)孵育显色，光镜下控制显示结果，蒸馏水漂洗。免疫结果分析：从各组随机选取5张切片，每张切片随机选取5个不同重叠视野，采用华东理工大学自动化所细胞免疫组织化学分析系统Version2.0自动分析仪记录阳性细胞百分率。

　　3.2BBB评分采用BBB评分法[3]。评定区域为直径100cm的圆形区域，地面为光滑塑料。大鼠脊髓损伤后5周由熟悉该评分标准的非本组实验人员进行测定。

　　4统计学方法

　　数据行SPSS10.0软件处理，以均数±标准差(x±s)表示，2组均数比较采用t检验，3组比较采用单因素Anova分析，检验结果以P<0.05为统计学相差显著，P<0.01为相差非常显著。

　　结果

　　3种NOS免疫组化：S组中iNOS呈阴性表达，内皮细胞型NOS(nNOS)表达同其他两组比较有极显著差异(P<0.01)，神经型NOS(eNOS)表达同C组比较差异显著(P<0.05);DFO组同C组比较，iNOS、nNOS和eNOS表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)，详见表1及图1~3。BBB评分：脊髓损伤后5周，DFO组BBB评分高于C组(见表1)。表1伤后4小时组脊髓组织3种NOS含量及伤后5周BBB评分情况(略)

　　讨论

　　1游离铁在脊髓继发损伤中的作用

　　铁代谢对脊髓组织的功能活动极为重要，但高浓度的游离铁离子存在于细胞内或细胞周围却是非常有害的。脊髓损伤后，由于各种原因导致脊髓组织的损伤，细胞死亡，质膜破损，从而导致“催化性”铁离子的释放，而铁离子会催化活性氧自由基的产生，进一步加重脊髓组织的损伤。Liu等[4]发现，在脊髓继发损伤的早期阶段羟基铁离子起着非常重要的作用。

　　2脊髓损伤后NOS的变化规律

　　NOS有3种异构体，分别为eNOS、nNOS和iNOS。eNOS、nNOS合称固有型一氧化氮合酶(cNOS)。cNOS的活性为钙依赖性，在正常生理条件下，催化合成基础量的NO，抑制血小板聚集和黏附，从而维持血管舒张状态，保持组织器官血流量在生理水平;iNOS的活性为非钙依赖性，正常生理状态下含量极微，而脊髓损伤后须经炎症介质或细胞因子等诱导，产生的NO量大、持续时间长，可通过直接引起过氧化损伤或作为信号介质介导其它炎症因子加重脊髓继发损伤。有关脊髓伤后iNOS的表达规律及作用文献报道是一致的，但有关eNOS、nNOS的报道却大相径庭。刘成龙等[5]研究表明，脊髓损伤后nNOSmRNA表达迅速增强，在伤后6小时达到高峰，nNOS参与了继发性脊髓损伤过程，并可能是一种损伤因素。DiazRuiz等[6]研究发现，在大鼠脊髓损伤4小时后，nNOS和eNOS活性明显增强。Vaziri等[7]研究发现nNOS在脊髓损伤后1天未见明显变化，而在损伤后14天表达明显下降，认为eNOS和iNOS在脊髓继发损伤中起着重要作用，而同nNOS无关。Miscusi等[8]发现，在大鼠脊髓损伤15分钟后，nNOS活性降低，未见eNOS表达。Sharma等[9]通过切断T10~11节段脊髓背角建立大鼠脊髓损伤模型，发现在临近损伤的T9和T12，cNOS活性明显增强，而在损伤节段iNOS活性明显增强，认为cNOS和iNOS均参与了脊髓的继发损伤。

　　Chatzipanteli等[10]建立大鼠T10节段脊髓打击模型，发现在伤后3、6、24小时损伤节段cNOS活性明显降低，在损伤后3小时临近节段cNOS亦明显降低，在T8节段cNOS 活性恢复到S组水平在伤后6小时在T8、T11 、T12节段，伤后1天在T10和T9节段恢复正常水平。iNOS 在各个节段及时段均明显增强，作者认为，cNOS和iNOS在脊髓损伤后的的活性成区域性及时段性变化。在本研究中，C组与DFO组中iNOS和nNOS表达均显著升高，同C组比较差异显著，但DFO组eNOS表达同S组比较无显著差别。我们认为，之所以会出现在脊髓伤后cNOS变化不一致的结果可能同实验模型及伤后时间点的选择不同有关。

　　3DFO对脊髓的保护作用及对3种NOS表达的影响

　　脊髓损伤后，钙离子大量内流，可使cNOS活性增高，同时由于炎症反应，诱导iNOS产生，使局部NO产生增多，从而加重脊髓组织的损伤，同时，脊髓组织损伤后，铁离子浓度增高，铁离子除了参与活性氧的产生外，自身在氧化还原过程中所形成的与氧结合的复合物也能引起脂质过氧化并改变细胞内钙离子的浓度[11]。去铁敏是一种高选择性的铁离子络合剂，它对三价游离铁的络合作用很强，1分子的去铁敏能结合3分子的铁离子，使活性铁浓度降低或使游离的铁得以清除。在本研究中，经去铁敏治疗后，脊髓组织游离铁的浓度、及MDA含量均明显下降，iNOS、cNOS免疫活性均低于S组，5周BBB评分高于S组。已有研究[3]证实，去铁敏能明显地降低脊髓组织损伤后由铁离子引发的脊髓组织脂质过氧化反应，但其对脊髓损伤后DFO对NOS表达的影响的研究却未见报道，在本研究中，DFO可使伤后NOS活性降低，其可能机制为：(1)通过阻断铁离子引发的脊髓组织脂质过氧化反应而减轻脊髓组织的炎症反应，减少iNOS的表达;(2)通过减轻脊髓组织细胞内钙超载，降低cNOS的活性，并从而从另一途径减少了脊髓组织的继发损伤程度。

　　【参考文献】

　　[1]刘锦波,唐天驷,肖德生,等.游离铁在实验性脊髓损伤后的动态变化及意义[J].中华物理医学与康复杂志，2002,24(4):206-208.

　　[2]Freeman LW,Wright GW.Experimental observations of concussion and contusion of the spinal cord[J].Ann Surg,1953,137(4):433.

　　[3]Basso DM,Bettie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(1):1-21.

　　[4]Liu D,Liu J,Sun D,et al.Spinal cord injury increases iron levels: catalytic production of hydroxyl radicals[J].Free Biol Med,2003,34(1):64-71.

　　[5]刘成龙,靳安民,周初松,等.实验脊髓损伤后神经型一氧化氮合酶基因表达的变化[J].中国临床解剖学杂志,2002,20(1):56-57.

　　[6]DiazRuiz A,Vergara P,PerezSeveriano F,et al.CyclosporinA inhibits constitutive nitric oxide synthase activity and neuronal and endothelial nitric oxide synthase expressions after spinal cord injury in rats[J].Neurochem Res,2005,30(2):245-251.

　　[7]Vaziri ND,Lee YS,Lin CY,et al.NAD(P)H oxidase,superoxide dismutase,catalase,glutathione peroxidase and nitric oxide synthase expression in subacute spinal cord injury[J].Brain Res,2004,995(1):76-83.

　　[8]Miscusi M.The role of constitutive nitric oxide synthase in pathogenesis of secondary lesion after spinal cord injury.Preliminary results[J].J Neurosurg Sci,2002,46(2):55-59.

　　[9]Sharma HS,Sjoquist PO,Alm P.A new antioxidant compound H290151 attenuates spinal cord injury induced expression of constitutive and inducible isoforms of nitric oxide synthase and edema formation in the rat[J].Acta Neurochir Suppl,2003,86:415-420.

　　[10]Chatzipanteli K,Garcia R,Marcillo AE,et al.Temporal and segmental distribution of constitutive and inducible nitric oxide synthases after traumatic spinal cord injury: effect of aminoguanidine treatment[J].J Neurotrauma,2002,19(5):639-651.

　　[11]梁朝革,贾连顺.铁与脊髓缺血再灌注损伤[J].脊柱外科杂志,2003,1(6):361-364.