大鼠中度脊髓损伤后两种后肢行为学评估标准的比较研究

　　作者：潘峰，陈安民，祝成亮，陶凤华 作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北 武汉430030;武汉大学生命科学院，湖北 武汉430072

　　【摘要】 目的对大鼠中度脊髓损伤后两种后肢行为学评估标准进行评价。方法24 只雄性 Wistar 大鼠随机分为假手术组和损伤组。损伤组采用Allen's打击法制作脊髓损伤模型，假手术组仅行椎板切除术。术后1、3、7、14、21天分别采用Tarlov评分和BBB(basso,beattie and bresnahan)评分对两组大鼠后肢运动功能恢复情况进行评估。结果两组大鼠BBB评分值在伤后各时间点差异均非常显著(P<0.01)，Tarlov评分值在伤后各时间点有显著性差异(P<0.05)，但只在 1、3、7天时差异才非常显著(P<0.01);评分值按百分制换算后，假手术组大鼠两组评分值之间的一致性较好，仅在伤后7天时有显著性差异(P<0.05)，损伤组大鼠两组评分值之间的差异较大，伤后1、3、7天时差异非常显著(P<0.01)。结论BBB评分的敏感性和区分度优于Tarlov评分，能更准确、客观地反映大鼠中度脊髓损伤后运动功能恢复情况。

　　【关键词】 脊髓损伤;下肢;行为学;评估标准;比较研究;大鼠

　　Comparative study on two hindlimb behavior evaluation systems following moderate spinal cord injury in rats

　　PAN Feng,CHEN Anmin,ZHU Chenliang,et al.

　　Department of Orthopaedics,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China

　　Abstract:ObjectiveTo compare two hindlimb behavior evaluation systems following moderate spinal cord injury(SCI) in rats.MethodsTwentyfour male rats were divided randomly into two groups: the shamoperation group and the injury group.The latter was subjected to contusion SCI at the T10 vertebrae level with a weightdrop impactor(10g weight was dropped from a 4.0cm height),while the former received only laminectomy.The hindlimb locomotor function of rats in both groups was evaluated by using Tarlov technique and BBB scale respectively at 1,3,7,14,21d after SCI.ResultsAccording to BBB scale,there was significant difference between two groups at all observing points after SCI(P<0.01),while values from Tarlov technique were significantly different between two groups but highly different only at 1,3,7d after SCI(P<0.01).After changed into percentage,values from two evaluation systems in the shamoperation group conformed considerably to each other, with significant difference only at 7 d after SCI(P<0.05),while values in the injury group differed remarkably from each other,with significant difference at 1, 3, 7d after SCI(P<0.01).ConclusionBBB scale may be superior to Tarlov technique in sensitivity and discrimination and better reflect the hindlimb locomotor function recovery after moderate SCI in rats.

　　Key words:spinal cord injury;limbs;behavior;evaluation system;comparative study;rats

　　脊髓损伤后对实验动物后肢运动功能的评估直接反映了脊髓修复与再生水平，以及外周运动功能的改善情况，对于评价各种治疗干预措施的效果而言是不可缺的。尽管目前很多研究是借助仪器测定后肢诱发电位，但诱发电位的改变并不能与运动功能的改变相一致。因此，选择一种客观、准确的后肢运动功能评估标准对动物模型的评价是至关重要的。但不同文献采用不同的评估标准却并没有说明其理由，究竟哪一种评估标准更客观，更具代表性，更能反映真实情况?本实验就目前文献中最常采用的Tarlov及BBB(basso,beattie and bresnaban)评估标准对脊髓损伤大鼠后肢运动功能的评价进行了比较研究，旨在明确哪一种评估标准更切合脊髓损伤后的功能状态。

　　材料与方法

　　1动物分组及脊髓损伤模型制作

　　24只成年雄性健康Wistar大鼠(武汉大学实验动物中心提供)，体重250～300g。随机分为假手术组和损伤组，每组12只。参考Basso 等[1]报道的改良Allen打击法制备大鼠脊髓损伤模型。1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔内注射麻醉后，在无菌操作下于背侧入路暴露脊髓T10节段，以脊髓后正中血管为中心，用直径3mm的重锤下落打击装置造成脊髓中度损伤(打击力量为10×4 g ·cm)，损伤脊髓局部用明胶海绵填塞止血，逐层缝合切口。符合以下条件的大鼠入选损伤组：(1)撞击处脊髓立即变为灰暗，鼠尾痉挛性摆动，双后肢及躯体回缩性扑动，随后双后肢呈弛缓性瘫痪;(2)体温稳定在36～37 ℃。假手术组大鼠除不损伤脊髓外，其余手术过程与损伤组相同。术后处理：室温维持在 25 ℃ 左右，保持干燥通风。每只大鼠分笼饲养，自由进食和饮水，定时协助损伤组大鼠排尿、排便。

　　2功能评价标准及方法

　　采用Tarlov评分法[2]和BBB评分法[1]分别对大鼠后肢运动功能进行评定。所有大鼠均在术前进行上述两项功能评估，取得正常值范围;术后 1、3、7、14、21天再分别对两组大鼠进行功能评估。评分前所有动物均检查膀胱是否充盈，防止因膀胱充盈而影响活动。评分采用双人、双盲法，评分者为非本实验组人员且熟知评分标准，每人分别对大鼠一侧后肢独立进行两项功能评估，每项指标共测定 3 次，取平均值;若两人所得分值不等，则再取平均值[3]。Tarlov评分法：0级，无自主性运动;1级，仅限于髋、膝关节的非反射性运动;2级，肢体髋、膝、踝3个主要关节的运动;3级，能主动支持体重和不协调步态，或偶尔出现协调步态;4级，前肢和后肢协调的步态，行走时有趾间关节的运动;5级，正常步态。BBB评分法：具体评分标准见文献1。

　　3数据处理及统计学分析

　　先将两组大鼠按不同评估标准所得分值进行组间比较，再将所有评分值按百分制换算后进行不同评估标准间的比较。采用统计分析软件 SPSS 12.0 进行处理，计量资料以x±s表示，两组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异非常显著。

　　结果

　　本组大鼠术前BBB评分为21分，Tarlov评分为5分。假手术组大鼠在伤后1~3天内上述两项评分轻度减低，至伤后7天时已恢复至接近正常水平，伤后14~21天两项评分均保持稳定。损伤组大鼠伤后短时间内双后肢功能完全丧失，肌力降为零，动物俯卧位行走，尿潴留，呈现出脊髓休克表现。损伤组伤后1~3天是其功能下降最大的时期，仅能见到大鼠后肢1~2个关节活动，上述两项评分均达最低值，伤后7天大鼠后肢肌力逐渐开始恢复，伤后14～21天大鼠脊髓功能恢复程度进一步增加，上述两项评分均于伤后21天达峰值。BBB评分结果显示，两组大鼠在伤后各时间点相比差异均非常显著(P<0.01)，见图1。Tarlov评分显示伤后各时间点相比两组大鼠之间有显著性差异(P<0.05)，但只在前3个时间点，即伤后1、3、7天这种差异才非常显著(P<0.01)，见图2。

　　为便于同组内不同评估标准之间的横向比较，将BBB评分和Tarlov评分结果均按百分制进行换算，结果见表1。表内数据显示，假手术组大鼠上述两项评分除在伤后7天时相比有显著性差异外(P<0.05)，其余各时间点均无显著性差异(P>0.05)，假手术组不同评估标准所得评分值之间的一致性较好。损伤组大鼠两组评分值之间的差异较大，伤后1、3、7天两项评分结果之间差异非常显著(P<0.01)，伤后14、21天功能恢复进入平台期，两组评分值之间的差距缩小，差异无显著性(P>0.05)。表1两组大鼠术后各时间点不同评估标准评分结果按百分制换算后的比较(略)

　　讨论

　　脊髓损伤实验研究的观察方法，主要包括脊髓功能观察、神经电生理检查和组织形态学观察等，几种观察指标的综合评定可以比较客观地反映脊髓的损伤程度及恢复程度[4]。开放场地试验是评估实验性脊髓损伤后动物后肢运动功能最常采用的方法之一，目前文献报道中较全面且应用较好、较多的主要有BBB及Tarlov两种评估标准。Tarlov评分于1954年首次提出后即为大多数文献所采用，对灵长类是准确的，但对种属低一些的动物，如啮齿动物却缺乏准确性，有些指标难以观察。所以近年出现了许多改良的Tarlov评分，本实验所采用的即为Cheng等[2]于1996年提出的以大鼠为观察对象的评估标准。1995年，Basso、Beattie和Bresnahan提出一种以3人姓氏首写字母命名为BBB的新评估标准(BBB rating scale)，专门用于评价大鼠胸髓损伤后后肢运动功能恢复情况。该评估标准包括许多评定细节和特征说明，分级较细致 (0～21 分)，体现了脊髓损伤恢复的全过程。在实际操作中，2种方法都存在人为的主观因素干扰，而不同文献采用不同的评估标准但并没有说明使用该方法的理由，似乎是依个人的选择。究竟哪一种评估标准更客观，更具代表性，更能反映真实情况?国外曾有文献[5]报道，按不同损伤程度制备大鼠脊髓损伤模型后采用Tarlov评分进行后肢运动功能评价，认为Tarlov评分与脊髓损伤程度、神经功能恢复及残存轴突计数等的相关性较好。亦有相反报道[6]。但在脊髓损伤实验研究中实际应用的并不是不同的损伤程度对功能恢复的影响，而是在一既定损伤程度的动物模型中，观察一种或几种干预措施对脊髓损伤后不同时间点功能恢复的影响，这就需要我们采用更为敏感的、能尽可能的将有显著性差异的行为学评分时间点鉴别出来的评估标准。从本实验结果来看，假手术组大鼠伤后短时间内BBB及Tarlov评分轻度减低，推测为椎板切除术中可能对脊髓侵扰，术后局部炎症水肿所致，之后均恢复至接近正常水平。而在损伤组大鼠，BBB评分显示伤后各时间点脊髓功能有明显下降，与假手术组之间差异非常显著(P<0.01)，说明在整个观察期内BBB评分均能较好地区分损伤对脊髓功能造成的影响，且区分度并未因损伤后期脊髓功能评分值的上升而有所减弱;Tarlov评分结果显示，在伤后1、3、7天时损伤组与假手术组之间的差异非常显著(P<0.01)，但随着脊髓功能的恢复，评分值的进一步升高并进入平台期，Tarlov评分对两组大鼠功能恢复程度之间差异的区分度有所下降(P<0.05)，表明在脊髓损伤后早期，两种评分标准均能准确鉴别出损伤对脊髓功能产生的影响，而在脊髓功能恢复后期，Tarlov评分的敏感性要低于BBB评分。

　　以往的相关实验[5，6]局限于同一评估标准内的比较，缺乏不同标准之间的比较，本实验通过将两种评估体系标准化为百分制，使得彼此间的横向比较成为可能。假手术组大鼠的BBB和Tarlov评分除在伤后7天时相比有显著性差异外(P<0.05)，其余各时间点均无显著性差异(P>0.05)，说明在脊髓损伤程度较轻时不同评估标准所得评分值之间的一致性较好。而在损伤组大鼠可以观察到伤后各时间点两组评分值之间的差异较大，其中伤后 1、3、7天两项评分结果之间差异非常显著(P<0.01)，而在伤后14、21天两组评分值之间的差异无显著性(P>0.05)，提示在脊髓损伤后早期，尽管两种评分标准均能鉴别出损伤对脊髓功能产生的影响，但BBB评分更为敏感，更能将这种损伤造成的组间差距在统计学上反映出来;在脊髓功能恢复的后期，虽然两组评分值之间无显著性差异，但反映在具体数值上，BBB评分的区分度仍要优于Tarlov评分。而且从两组大鼠运用不同评估标准所得分值来看，BBB评分所反映的组间差距在伤后各时间点均较Tarlov评分明显，从而从总体上说明BBB评分的区分度和敏感性要优于Tarlov评分。

　　综上所述，BBB评分能更客观、准确的反映大鼠脊髓损伤后的功能恢复过程，值得在实验研究中进一步推广。同时在实际操作中宜采用双盲、双人分别独立观察两侧不同后肢，最后取均值的方法，以最大限度减少因主观评分导致的结果失真。

　　【参考文献】

　　[1]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weightdrop device versus transaction [J].Exp Neurol,1996,139(2):244-256.

　　[2]Cheng H,Cao Y,Olson L.Spinal cord repair in adult paraplegic rats: partial restoration of hind limb function[J].Science,1996,273(5274):510-513.

　　[3]张岩,李艺影,赵继宗,等.Clenbuterol对大鼠脊髓损伤后运动功能恢复作用研究[J].中国康复理论与实践,2005,11(7):546-547.

　　[4]徐帆,陈建敏,张晓.脊髓损伤动物模型的制备及神经功能评价[J].创伤外科杂志,2007,9(1):91-93.

　　[5]Fehlings MG,Tator CH.The relationships among the severity of spinal cord injury,residual neurological function, axon counts,and counts of retrogradely labeled neurons after experimental spinal cord injury[J].Exp Neurol,1995,132(2):220-228.

　　[6]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.Descending systems contributing to locomotor recovery after mild or moderate spinal cord injury in rats: experimental evidence and a review of literature[J].Restor Neurol Neurosci,2002,20(5):189-218.