V1a/V2受体在精氨酸血管加压素恢复失血诱导大鼠血管低反应性中的作用

　　作者：杨光明，李涛，徐竞，明佳，刘良明 作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所第二研究室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042

　　【摘要】 目的 探讨精氨酸血管加压素(AVP)在恢复失血性休克动物血管反应性和钙敏感性中的可能机制和血管加压素V1a、V2受体对其的作用。方法 实验分2部分：在体实验，观察AVP(0.04、0.1、0.4 U/kg)对失血性休克大鼠肠系膜动脉(SMA)血管管径对去甲肾上腺素(NE)收缩反应性的影响;离体实验，取失血性休克大鼠SMA环，利用离体血管环张力测定技术，观察V1a和V2受体拮抗剂对AVP恢复失血性休克大鼠肠系膜动脉反应性和钙敏感性的影响。结果 失血性休克后，大鼠肠系膜动脉对NE的收缩反应性明显降低，AVP各剂量均明显升高了休克大鼠SMA对NE 的收缩反应。离体实验，AVP(5×10-10mol/L)可明显恢复休克后的血管低反应性和钙失敏;而AVP V1a受体拮抗剂预处理可明显抑制AVP诱导的SMA对NE和Ca2+的反应性升高(P<0.01)，V2受体拮抗剂也部分抑制了AVP的作用。结论 AVP恢复失血性休克动物血管反应性和钙敏感性的机制与其V1a和V2受体有关，其中V1a受体可能发挥着更为重要的作用。

　　【关键词】 失血性休克;精氨酸;血管加压素;受体;血管反应性

　　Effect of V1a and V2 receptor on the increase of vascular reactivity　after hemorrhagic shock induced by arginine vasopressin

　　YANG Guangming,LI Tao,XU Jing,et al.

　　(State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury,Department 2,Institute of Surgery Research,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

　　Abstract: Objective To observe the effect of AVP on vascular reactivity and calcium sensitivity following hemorrhagic shock and its relations to V1a and V2 receptor in rats.Methods In vivo,the effects of AVP (0.04,0.1 and 0.4U/kg) on the vasoconstriction of superior mesenteric artery (SMA) to norepinephrine (NE) were observed in hemorrhagic shock (30 mmHg for 2 hours) rats.In vitro,the effects of V1a and V2 receptor inhibitor on the increase of vascular reactivity and calcium sensitivity of SMA from hemorrhagic shock rats induced by arginine vasopressin were observed.Results In vivo,AVP (0.04,0.1 and 0.4U/kg) significantly increased the vasoconstriction of SMA to NE in hemorrhagic shock rats,and in vitro,AVP (5×10-10mol/L) pretreatment also improved reactivity of SMA to NE and calcium following hemorrhagic shock.The V1a receptor inhibitor significantly antagonized AVPinduced increase of vascular reactivity and calcium sensitivity of SMA following hemorrhagic shock and V2 receptor inhibitor also partly inhibited this effect.Conclusion AVP may restore the decreased vascular reactivity and calcium sensitivity of vascular smooth muscle after hemorrhagic shock through V1a and V2 receptor,and V1a receptor may play more important role than V2 receptor.

　　Key words:hemorrhagic shock;arginine;vasopressin;receptor;vascular reactivity

　　精氨酸血管加压素(arginine vasopressin，AVP)从1954年被发现以来，其抗利尿作用已经明确。近年来随着研究深入，发现AVP对感染性休克、血管扩张性休克等有较好的治疗效果[1]。本实验室将其应用于失血性休克动物的治疗，结果表明，AVP能显著增加失血性休克大鼠的血管反应性和血管平滑肌钙敏感性[2]，但其作用机制尚不清楚。本实验拟利用大鼠失血性休克模型，对AVP在恢复失血性休克动物血管反应性和钙敏感性中的可能机制进行探讨，重点观察AVP V1a、V2受体的作用。

　　材料与方法

　　1 实验动物

　　Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重200～250g。

　　2 实验方法

　　2.1 观察AVP对NE诱导休克大鼠肠系膜上动脉血管收缩反应 Wistar大鼠30只，随机分为5组，每组6只，分别为：正常对照组、休克对照组、休克+AVP 0.04、0.1、0.4 U/kg组。实验前12小时禁食、自由饮水。实验当日用3%戊巴比妥钠(30mk/kg)腹腔注射麻醉后，右侧股动脉插管供观察血压和放血，股静脉供复苏和给药，经插管注射肝素钠生理盐水(500U/kg)抗凝。剪去腹毛，沿腹正中线纵向剖开长约3～4cm切口，暴露肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)。术毕，大鼠稳定10分钟，然后经股动脉插管，10分钟内放血至血压30mmHg，并维持在此水平2小时。然后，AVP组分别按照0.04、0.1、0.4U/kg的剂量加入到3倍失血量的复方氯化钠溶液于30分钟内用输液泵输注;休克对照组仅予3倍失血量的复方氯化钠溶液;正常对照组仅插管，不放血、不给药。休克前、休克2小时、给药复苏后0.5、1、2、3小时分别从股静脉给NE(3μg/kg)，测量给NE前及NE后的SMA血管管径值(分别用D0和DNE表示)。SMA血管管径对NE的收缩反应以给NE前与给NE后的SMA血管管径的差值占给NE前血管管径的百分比表示血管收缩率，计算公式为：(D0-DNE)/D0×100%。

　　2.2 观察AVP恢复失血性休克SMA血管反应性和钙敏感性及其与V1a/V2受体的关系 40只大鼠随机分为正常对照组、休克对照组、休克+AVP(5×10-10mol/L)组、休克+AVP+V1a受体拮抗剂([d(CH2)5Tyr2(Me)]AVP，10-7mol/L)组、休克+AVP+V2受体拮抗剂([d(CH2)(dIle2Abu4)]AVP，10-7mol/L)组，每组8只。按前法复制模型，处死大鼠，取肠系膜上动脉，清除周围结缔组织，制成2～3mm长的血管环。正常大鼠插管放置2小时后活杀制备血管环。为了排除内皮细胞对血管反应性的影响，用自制的螺旋状钢丝条伸入血管腔内转动3～5圈去除内皮细胞。每只大鼠制备血管环2根，1根用于血管反应性测定，另1根用于钙敏感性测定。

　　血管反应性和钙敏感性测定：采用离体血管环张力测定技术，分别测定SMA环对NE(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)和CaCl2(3×10-5、10-4、3×10-4、10-3、2×10-3、6×10-3、10-2、3×10-2mol/L)的收缩反应，以NE和Ca2+的最大收缩张力(Emax)和pD2(达到50%最大反应的激动剂浓度)以及量-效曲线评价血管反应性和钙敏感性，具体方法参见文献[3]。测定前，AVP组用AVP(5×10-10mol/L)孵育10分钟;AVP+V1a受体拮抗剂组和AVP+V2受体拮抗剂组先分别用[d(CH2)5Tyr2(Me)]AVP、[d(CH2)(dIle2Abu4)]AVP预孵育10分钟，然后用AVP孵育10分钟，再观察血管环对NE和Ca2+的收缩反应。

　　3 数据处理及统计学分析

　　所有数据均以以±s表示。SMA对NE反应性及钙敏感性用单因素方差分析;方差分析有统计学意义的组间比较采用q检验。P<0.05为相差显著;P<0.01为相差非常显著。

　　结果

　　1 AVP对NE诱导休克大鼠肠系膜上动脉血管收缩反应的影响

　　结果显示，休克后大鼠肠系膜上动脉对NE诱导的收缩反应发生了显著变化，与正常对照相比，休克对照组在休克后各时相点NE诱导SMA收缩反应明显低于正常对照组(P<0.05～0.01)，3个剂量的AVP(0.04、0.1、0.4U/kg)处理均使休克SMA对NE的收缩反应性升高。在给药1小时后，AVP(0.4U/kg)处理组的NE诱导的管径收缩率显著升高甚至略高于正常水平(图1)。

　　2 AVP恢复失血性休克SMA血管反应性和钙敏感性与V1a/V2受体的关系

　　失血性休克使血管反应性和血管平滑肌对钙的敏感性显著降低，AVP(5×10-10mol/L)可显著升高休克大鼠SMA对NE的反应性和钙敏感性(P<0.01)。而血管加压素V1a受体拮抗剂[d(CH2)5Tyr2(Me)]AVP预处理可明显抑制AVP诱导的SMA对NE和Ca2+的反应性升高(P<0.01)，使NE和Ca2+的量效曲线明显右移，Emax降低(P<0.01);V2受体拮抗剂[d(CH2)(dIle2Abu4)]AVP预处理也部分抑制了AVP的作用(P<0.05～0.01)(图2)。以正常组NE和Ca2+的Emax为100%，休克组、AVP组、AVP+V1a受体拮抗剂组和AVP+V2受体拮抗剂组NE的Emax分别为正常组的82.6%、103.9%、86.3%、94.6%，而Ca2+的Emax分别为正常组的71.9%、111.6%、87.3%、98.2%。

　　与正常对照组比较：#P<0.05，##P<0.01;与休克对照组比较：*P<0.05，**P<0.01;与休克+AVP(0.04U/kg)组比较：^P<0.05，^^P<0.01

　　图1 AVP对NE诱导休克大鼠肠系膜上动脉血管收缩反应的影响(略)

　　与正常对照组比较：#P<0.05，##P<0.01;与休克对照组比较：*P<0.05，**P<0.01;与休克+AVP(5×10-10mol/L)组比较：^P<0.05，^^P<0.01

　　图2 V1a/V2受体拮抗剂对AVP诱导的失血性休克大鼠SMA血管反应性(a)和钙敏感性(b)升高的影响(略)

　　讨论

　　精氨酸血管加压素(AVP)为含9个氨基酸的环状神经内分泌多肽。其生理范围是2.8×10-13～2.8×10-11mol/L，血液浓度<3.7×10-12mol/L，在应激情况下可大幅度升高，如禁水后48小时可升高至3.7×10-11mol/L，严重创伤/休克时可超过5.5×10-10mol/L。AVP的这种血液中浓度增加可引起广泛的血管收缩，有助于休克初期维持血压、保证器官血流灌注。研究发现，长时间的休克可使血中AVP浓度下降。Sharshar等[4]观察到在重度休克时血管加压素在神经垂体存在储存耗竭现象，这可能是休克晚期的顽固性低血压的原因之一。国内外一些相关报道证明，给予AVP对多种休克具有明显的升压效应，但尚未见AVP是否通过恢复休克病人血管反应性来发挥其抗休克作用的报道。我们对此进行了研究，结果显示AVP能使失血性休克大鼠的血压及NE的升血压效应回升，并显著恢复了休克大鼠肠系膜上动脉对NE的收缩反应，这提示了AVP对休克后全身和局部血管反应性都有显著的恢复作用。

　　AVP通过与其受体结合来发挥细胞内不同的生物效应，其受体属于G蛋白偶联受体，主要包括V1a、V1b(V3)、V2、催产素(OTR)受体和嘌呤类受体(P2受体)[5]。V1a和V1b受体耦联于磷脂酰肌醇信号传递系统，以Ca2+为第二信使，外周V1a受体主要分布于血管和肝脏，AVP结合到V1a受体上可引起血管平滑肌收缩、促进肝糖原分解、增加血小板的聚集性[6]，V1b受体主要分布于腺垂体，调节ACTH的释放，而分布于中枢神经系统的V1受体与颅内压和脑组织水代谢调节以及学习和记忆活动有关;V2受体耦联于腺苷酸环化酶信号传递系统，以cAMP为第二信使，主要分布于肾远曲小管和集合管，产生抗利尿作用[7];OTR受体是AVP非选择性的受体，主要分布在血管内皮细胞，产生NO依赖性的扩血管作用，这一功能在重要生命脏器上显得格外突出，如扩张颅内Willis环、扩张冠状动脉、降低肺动脉阻力;P2受体主要分布于心脏，参与心脏收缩调节。那么，在严重休克后，AVP是否通过其受体来发挥恢复血管反应性的作用?具体是哪一种受体发挥作用?

　　考虑到AVP不能通过血脑屏障，血液中AVP含量变化与脑脊液中的变化是相对独立的，我们重点研究了AVP V1a和V2受体的作用，并采用去除内皮的SMA环以排除内皮细胞的影响。结果显示，V1a和V2受体拮抗剂都抑制了AVP恢复失血性休克动物血管反应性和钙敏感性的作用，其中V1a受体可能发挥更为重要的作用。结合我们前期实验结果：AVP恢复休克后血管反应性的机制可能与激活了PKCα、δ亚型和Rho激酶有关[2，3]，它们是否位于同一条胞内信号传导途径上?AVP是通过受体来调节这些激酶分子，还是有其它途径来发挥其抗休克作用?AVP介导的细胞内网状调节机制十分复杂，经典的如V1受体-磷脂酶C(PLC)途径：AVP与V1受体结合后，通过核苷调节蛋白(GP)激活特异的细胞膜PLC，使细胞中的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP)水解为1,4,5三磷酸肌醇(IP3)和DAG，分别激活两条独立又互相协调的信号系统。IP3使内质网内贮Ca2+释放，胞浆中的Ca2+水平增高，激活Ca2+钙调蛋白依赖性蛋白激酶系统;而Ca2+和DAG共同激活PKC，产生血管收缩等效应[6]。然而，在休克后血管平滑肌细胞内钙超载的状态下，这条Ca2+依赖性的PLC机制是否仍然参与了休克后AVP通过PKC、Rho激酶来调节钙敏感性和血管反应性的过程，具有什么样的地位，尚无文献报道。此外，磷脂酶D(PLD)和磷脂酶A2(PLA2)也与参与了AVP诱导的PKC、Rho激酶激活，但文献报道的PLD和PLA2在AVP介导的胞内信号传导途径中的地位各不相同[8，9]，我们推测可能与不同的组织细胞激酶分子表达和不同的病理生理过程有关。而在休克后，PLD和PLA2在AVP调节钙敏感性信号传导途径中有着什么样的作用尚不清楚。

　　综上所述，AVP对休克后全身和局部血管反应性都有良好的恢复作用，并可能通过其V1a和V2受体来发挥作用，但它具体的信号传导途径尚需进一步研究阐明。

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