缺血后处理对后肢挤压伤兔全身炎症反应的抑制

作者：丁俊涛，张连阳    作者单位：(第三军医大学第三附属医院野战外科研究所，全军战创伤中心，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042) 　　【摘要】  目的 探讨两种缺血后处理方式(IP)对后肢挤压伤兔全身炎症反应的抑制作用。方法 建立兔后肢挤压伤模型，分别采用交替夹闭开放挤压伤侧髂总动静脉及交替捆绑松弛挤压伤肢体近端两种IP方式处理后肢挤压伤兔，检测处理前、处理后2、6、12、24小时后血浆白介素6(IL6)、白介素10(IL10)及肿瘤坏死因子α(TNFα)水平，比较两种处理方式组及对照组上述指标的变化。结果 IP组在上述处理后4个时相点IL6及TNFα水平均低于对照组(P<0.05)，处理后2、6、12小时血浆IL10水平高于对照组(P<0.05);但两种IP模式组间无差别(P>0.05)。结论 IP对后肢挤压伤早期兔全身炎症反应有抑制作用。

　　【关键词】  挤压伤;肢体;缺血;全身炎症反应综合征

　　AInhibition of ischemic postconditioning to SIRS on the model

　　of hind limb crush injury in rabbits

　　DING Juntao，ZHANG Lianyang

　　(Center of War Wound and Trauma of PLA,State Key Laboratory of Trauma,Burns and Combined Injury，

　　Institute of Surgery Research，Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

　　Abstract： Objective To discuss the inhibition of ischemic postconditioning to systemic inflammatory response syndrome (SIRS) in the model of hind limb crush injury in rabbits.Methods We established a rabbit hind limb crush injury model and two types of ischemic postconditioning in the models,i.e alternately clamp/open common iliac vessel and alternately bind/loosen the proximum of hind limb,and then performed examinations on serum level of interleukin6(IL6),interleukin10(IL10)and tumor necrosis factorα(TNFα) at 2,6,12 and 24 hours after injury.Results The serum levels of IL6 and TNFα at 2,6,12 and 24 hours after injury in two groups of ischemic postconditioning were higher,and a significant increase in serum level of IL10 at 2,6 and 12 hours after injury in two groups compared with the control group(P<0.05).But there was no difference between the two groups of ischemic postconditioning(P>0.05).Conclusion Ischemic postconditioning can inhibit SIRS on the model of hind limb crush injury in rabbits.

　　Key words:crush injury;limbs;ischemic;SIRS

　　全身炎症反应综合征(SIRS)是指机体由于各种严重感染、创伤、烧伤、低氧及再灌注损伤等感染与非感染因素刺激产生的一种失控的全身炎症反应的统称，在严重创伤如挤压伤后发病率较高。缺血再灌注的过程中，缺血时细胞破坏产生的大量炎性细胞因子、炎性递质于再灌注时进入循环而引起的扩大的炎症反应是全身炎症反应的重要原因，故有效控制创伤早期SIRS反应是防止病情进一步发展的关键[1，2]。缺血后处理(IP)是近年来提出的通过调动机体内源性保护机制减轻组织器官缺血再灌注损伤的新措施。IP在缺血后发生,即在组织较长时间缺血后，开始再灌注前立即给予多次短暂的停灌、复灌处理。目前关于IP的研究都是针对受损器官的保护，本研究借鉴这种处理方法并进行适当改进，其目的不是探讨对受损伤器官的作用，而是对全身炎症反应的抑制作用，类似Yang等[3]提出的远程IP方式。

　　材料与方法

　　1 模型与分组

　　1.1 动物与分组 新西兰纯种白兔52只，第三军医大学第三附属医院实验动物中心提供，普通级，雌雄不限，体重2.03～2.55kg，普通喂养。随机取16只兔制作后肢挤压伤模型。模型制作成功后，将其余36只随机分为3组：对照组(后肢挤压伤模型)，缺血后处理A组(IP A，交替夹闭开放挤压伤侧髂总静脉模式)，缺血后处理B组(IP B，交替捆绑松弛挤压伤肢体近端模式)，每组12只。

　　1.2 兔后肢挤压伤模型 新西兰纯种白兔16只，随机分为2组，每组8只。以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)经外耳静脉注入麻醉，右后肢以木制夹板固定，施加25kg重物挤压，按挤压时间分为4小时组和10小时组。挤压前、挤压后12小时分别由耳中央动脉采血3ml，等量肝素抗凝后3200rpm/min离心20分钟，取上清液，检测肌酸激酶同工酶(CKMB)[羊抗兔CKMB酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒;ADL,Inc.USA];由尿道无菌导尿5ml，3200rpm/min离心5分钟，取上清液，检测肌红蛋白(Mb)(羊抗兔Mb ELISA试剂盒;ADL,Inc.USA)。实验结果显示10小时组发生有临床意义的挤压伤，遂采用10小时组方式进行后续动物实验。

　　1.3 缺血后处理模型 (1)交替夹闭-开放挤压伤侧髂总动静脉的后处理模型：在解除兔后肢挤压之前，由腹股沟区作小切口分离右侧髂总静脉，无创血管夹夹闭髂总静脉后解除挤压，60秒后松开血管夹，60秒后再次夹闭，反复3次;(2)交替捆绑松弛挤压伤肢体近端的后处理模型：在解除兔后肢挤压之前，以止血带捆扎右后肢近端(距离挤压重物近侧约2cm，捆绑程度以解除挤压后不能触及兔后肢胫前动脉搏动为准)，解除挤压，60秒后解除捆绑，60秒后再次捆绑，反复3次。

　　2 检测指标

　　各组在挤压前、挤压后2、6、12、24小时由耳中央动脉采血3ml，等量肝素抗凝后3200rpm/min离心20分钟，取上清液，-20℃冰箱保存待测。实验结束后使用ELISA试剂盒[羊抗兔白介素6(IL6)、 羊抗兔白介素10(IL10)、羊抗兔肿瘤坏死因子a(TNFα) ELISA试剂盒;ADL,Inc.USA]统一检测血浆IL6、IL10及TNFα水平。各组兔实验结束后继续普通喂养30天，观察饮食、体重及受伤肢体活动情况。

　　3 统计方法

　　计量资料均采用±s表示，采用SPSS16.0版本对血浆IL6、TNFα及IL10值进行t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

        结 果

　　1 大体情况观察：实验兔饲养1个月，体重未见显著改变。除1只因腹泻死亡外，其余实验兔均存活。受挤压后肢有轻微活动障碍，未见坏死、感染。

　　2 兔后肢挤压4小时组挤压后血清CKMB及尿液Mb含量没有明显增高(P>0.05);10小时组挤压后血清CKMB及尿液Myo含量明显增高(P<0.05)(见表1)，认为发生了有临床意义的挤压伤。

　　3 各组血浆IL6水平在挤压解除后2小时即升高，12小时达到峰值，随后开始下降，24小时后仍高于挤压前水平。IP A组与IP B组在挤压解除后2、 6、12、24小时血浆IL6水平均低于对照组(P<0.05)。IP A组与IP B组血浆IL6水平在挤压解除后各时相点组间差异无显著性(P>0.05)(见表2)。

　　4 各组血浆IL10水平在挤压解除后2小时即降低，6小时达到最低值，随后开始上升，24小时后仍低于挤压前水平。IP A组与IP B组在挤压解除后2、6、12小时血浆IL10水平均高于对照组(P<0.05)。IP A组与IP B组血浆IL10水平在挤压解除后各时相点组间差异无显著性(P>0.05)(见表3)。

　　5 各组血浆TNFα水平在挤压解除后2小时即升高，12小时达到峰值，随后开始下降，24小时后仍高于挤压前水平。IP A组与IP B组在挤压解除后2、6、12、24小时血浆TNFα水平均低于对照组(P<0.05)。IP A组与IP B组血浆TNFα水平在挤压解除后各时相点组间差异无显著性(P>0.05)(见表4)。表1 挤压前后血浆CKMB及尿液Mb浓度(±s，ng/ml)与挤压前比较：△P>0.05，*P<0.05表2 各组在挤压前后各时相点血浆IL6水平

　　讨 论

　　IP最早是研究心脏再灌注损伤时提出的概念，Zhao等[4]在2003年对狗的缺血再灌注研究中发现，在心肌较长时间缺血后，开始再灌注前，对心脏进行3个短周期再灌/停灌处理，即30秒再灌/30秒再阻断，总时程达3分钟，可以缩小梗死面积、减轻细胞水肿，改善心功能，他把这种现象称之为IP。到目前为止，IP心脏、肾脏、心脏甚至大脑保护措施已经在不同动物模型上得到证实,而且已证实IP产生的心脏、肾脏保护作用确可达到与缺血预处理相似的效果[3-10]。但是这些处理方式均需要分离出供应受保护器官的主要动脉进行夹闭开放操作，在移植手术过程中可能具有应用价值，而在挤压伤的现场救治中，不可能进行这样的操作。本研究采用的交替捆绑-松弛挤压伤肢体近端模式可操作性强，在临床上更具有实用价值。

　　TNFα主要是由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生的细胞因子，是炎症反应中重要的参与物，主要通过增强中性粒细胞活性，产生活性氧，血小板活化因子等，引起炎症损伤，同时促进炎性细胞因子释放，引起炎症瀑布式放大效应。在缺血再灌注损伤中，TNFα表达增加，并且可能是许多致伤因子的重要启动因子。TNFα对免疫反应、炎症反应具有重要的调节和介导作用，可刺激单核巨噬细胞和其它细胞分泌IL1、lL6等炎性因子。而lL6主要来源为单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞以及非淋巴细胞类细胞产生的多功能细胞因子，参与机体炎症、免疫调节、造血、代谢等过程。IL6是目前所知的导致全身急性炎症反应的主要的细胞因子[11]。IL10又称细胞因子合成抑制因子(CSIF),主要生物活性是起免疫抑制作用,是一种抑制性细胞因子。IL10能够抑制T细胞、单核巨噬细胞的激活和效应功能,抑制和终止炎症反应。近年来,有不少研究结果表明，IL10在改善肝脏及肺脏缺血再灌注损伤方面具有重要意义[12，13]。本研究选用这三项指标作为判断挤压伤IP对全身炎症反应综合征的影响，既可反映全身炎症严重程度，又可以评价IP对全身炎症的抑制作用。与对照组相比，经IP的实验动物血浆中TNFα和IL6水平在处理后早期较低，表明IP对后肢挤压伤早期兔全身炎症反应具有抑制作用;而在IP早期IL10水平较对照组高，同样表明该处理方式可抑制炎症反应。关于IP对全身炎症反应抑制的机制，可能是这种处理方式延缓并控制了局部坏死组织和炎症递质释放，让机体建立了适宜的细胞应激机制，促进了内源性保护机制的启动，减轻了再灌注引起的氧应激损伤，进而实现预防挤压伤后器官衰竭的发生或减轻其对各器官的损害程度。

　　本文采取两种缺血后处理方式研究其对挤压伤后对全身炎症反应的抑制作用并探讨了两种方式保护效果的差别，结果显示，交替捆绑松弛挤压伤肢体近端模式与传统的动脉夹闭方式类似，对全身炎症反应具有抑制作用。而交替捆绑松弛挤压伤肢体近端方式可操作性强，在临床上更具有实用价值。本实验同时观察了兔肠道屏障情况，结果发现IP对肠道屏障亦有保护作用。因此认为，IP对于挤压伤的救治具有临床意义。本实验受挤压兔均饲养观察1个月，除因腹泻1只死亡外，其余实验兔受挤压后肢有轻微活动障碍，未见坏死、感染。因此本实验所研究的挤压伤为中等程度挤压伤，至于IP对严重挤压伤动物是否有保护作用尚待进一步研究。另外，需要进一步研究的是对肢体的捆绑压力以多大为宜以及最有效的停灌-复灌的时间间隔和重复次数。

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