神经干细胞、丙戊酸联合应用对成鼠脊髓损伤的修复作用

作者：王莉 伍亚民 刘媛 南国新 曾琳    作者单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所三室，创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室，重庆 400042 　　【摘要】  目的 观察神经干细胞(NSCs)和丙戊酸(VPA)联合应用对成年大鼠脊髓损伤后的修复作用。方法 SD大鼠随机分为单纯损伤组、NSCs移植组和NSCs+VPA治疗组。采用半切脊髓损伤模型,损伤后进行病理染色和神经诱发电位检测。结果 NSCs+VPA治疗组损伤处空洞闭合情况优于其余两组，移植物和宿主脊髓建立的纤维联系较其余两组多，排列有序。NSCs+VPA治疗组诱发电位各项指标匀优于其余两组，8周时最显著，其中以运动诱发电位（MEP）的优化最明显。结论 NSCs和VPA联合应用对成鼠脊髓损伤具有良好的修复作用。

　　【关键词】  脊髓损伤 神经干细胞 丙戊酸 创伤修复

　　脊髓损伤后由于受损的神经元无法再生，而胶质细胞大量增生，严重阻碍了脊髓功能的恢复。神经干细胞（neural stem cells，NSCs）移植成为当前治疗脊髓损伤的热点，然而大量的研究报道，NSCs移植到体内主要分化神经胶质细胞，仍然不能较好地修复损伤脊髓。本实验通过治疗癫痫常用药丙戊酸（valproic acid，VPA）和NSCs移植联合应用，拟为解决脊髓损伤修复中存在的问题提供新的思路。

        材料与方法

　　1  NSCs的培养与鉴定      　　取体重为220～250g的E13～15天SD孕鼠(第三军医大学大坪医院动物中心提供)1只，1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后消毒皮肤，打开腹腔，取出胎鼠置于冰台上。用眼科剪剪开头皮和骨，取出大脑皮层放入装有无钙平衡盐溶液（DHanks）的瓶中，再用眼科剪反复切割组织，缓慢吹打后，用细胞筛过滤制成单细胞悬液。以1000r/min离心5分钟，弃上清，加入神经元基础培养基（NB）培养液（内含N2添加剂，20ng/ml碱性成纤维生长因子，100μg/ml胰岛素，以上皆为Gibco产品），置入37℃、5％CO2培养箱培养，每6～7天传代1次。应用链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABC）免疫组化单标检测试剂盒（博士德，武汉）结合巢蛋白（Nestin）抗体（Pharmigen）来检测神经干细胞中的Nestin抗原。再取培养的NSCs球经血清分化后，用神经微丝200（NF200）单克隆抗体（Sigma） 和胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（Sigma）进行SABC双标免疫组化染色。

　　2  动物分组    　　成年SD大鼠，重220～250g（雌雄不拘），每个时相点6只动物，每组18只，共54只。随机将动物分为A组（单纯损伤组）、B组（ NSCs移植组）、C组（VPA+NSCs移植组）后行脊髓半切损伤；于手术后2、4、8周行病理染色和诱发电位检测。

　　3  脊髓损伤模型的制作与移植治疗    　　用1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，腰背部脱毛, 将动物固定在脑立体定位仪上。无菌条件下切开T9～T11处并切除T10椎板,暴露T10脊髓,用眼科虹膜刀横断并用玻璃针捣毁并吸出右侧半脊髓, 形成一约3mm×3mm×2mm大小的空洞。A组动物损伤后用90线缝合硬脊膜, 逐层缝合肌肉、皮肤并肌注青霉素1万U  3次/d，连续3天；B组动物在伤后于空洞处移植吸附于可吸收明胶海绵上的培养、鉴定后的15μl含5×105个神经干细胞的悬液，伤口处理同A组；C组动物手术处理同B组，同时300mg/（kg·d）腹腔注射VPA，分2次注射。手术后2、4、8周，进行病理染色和运动诱发电位检测。

　　4  标本制作及病理染色

　　4.1  灌注、取材  手术后2、4、8周，麻醉大鼠后将其固定于解剖板上，剪开胸腔、左心室插管，剪开右心耳，快速灌注生理盐水150～200ml，待流出液体清凉后，灌注4％多聚甲醛约200ml。灌注完成后，取出半切部位及其头、尾侧各3个节段的脊髓，再放入4％多聚甲醛后固定6小时。

　　4.2  切片、染色  取出瓶底大体标本经修整、石蜡包埋后以10μm连续切片，按常规方法进行苏木精伊红染色（HE）、Holmes银染等病理染色。

　　5  诱发电位检测    　　将受检测的动物用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉，在头颅后部、右腿部剪毛，消毒皮肤。切开头颅后部皮肤，剥离骨膜，用牙科钻在左侧皮层中央后回感觉区相对应的冠状缝后3mm、正中矢状缝向左旁开1mm处钻一直径约为3mm的盲孔，并暴露手术侧（右侧）的坐骨神经。用Powerlab/16SP诱发电位仪（刺激参数：频率4Hz，波宽0.2ms，强度4.5mA，信号经前置放大器放大10万倍，计算机平均256次）记录感觉诱发电位（SEP）和运动诱发电位（MEP）波形曲线，计算波峰和峰潜伏时。检测皮层SEP时，刺激电极位于坐骨神经，记录电极置于皮层表面，参考电极置于头皮下。检测MEP时，刺激电极与记录电极交换，参考电极位于硬腭下。健侧的测量方法同手术侧。组间比较采用t检验，并用SPSS软件进行统计学分析。

　　结果

　　1  神经干细胞鉴定    　　在光学显微镜下，神经干细胞球Nestin染色呈紫色，细胞为圆形，构成的细胞球大小不一。NF200和GFAP双标组化染色可见NF200免疫反应阳性细胞胞体较小、突起很长并有分支，为神经元；GFAP免疫阳性细胞为胞体较大、突起粗而大，数量众多，为星形胶质细胞（图1）。

　　2  苏木精伊红染色    　　损伤后第2周染色，A组损伤周围组织严重塌陷，超过半切范围；其余两组缺损范围较A组小，周围组织未见明显塌陷。第4周，A组的损伤部位形成空洞，周围组织塌陷减轻，可见增生胶质细胞；B组和C组缺损范围已明显减少，胶质细胞增生少。第8周，A组缺损部位仍为不闭合的空洞（图2）；其余两组缺损空洞进一步减小，移植物与周围组织融合好(图3)，在移植物中可见新生血管生成。

　　3  Holmes染色    　　损伤后第2周，各组均未观察到明显的再生神经纤维。第4周，A组移植物与周围宿主脊髓组织间仅见少量神经纤维联系，纤维排列紊乱，在移植部位与宿主脊髓交界处可见大量增生的胶质细胞，并形成明显的胶质细胞反应带(图4)；B组移植物与宿主脊髓间的分界仍然较明显，但可见两者间已建立起少量的神经纤维联系(图5)；C组中移植物与宿主脊髓融合良好，交界处没有明显的胶质反应带，再生神经纤维数量多，排列规则(图6)，并且移植部位可见移植神经干细胞分化的神经元(图7)。

　　4  诱发电位检测    　　在第2、4、8周的MEP和SEP峰潜伏时结果显示（见表1），各组在8周内峰潜伏时优化趋势较明显；在不同时相点，C组各项指标显著优于其它两组。2周时，C组同B组比较，MEP峰潜伏时明显缩短（P<0.05）；同A组比较，C组MEP峰潜伏时得到明显的改善；SEP峰潜伏时差异不显著。4周时，各组MEP峰潜伏时改变规律同2周，但C组的SEP峰潜伏时有所恢复。8周时，各组MEP、SE峰潜伏时改变趋势与4周时相同，但改变的程度更大些。

　　图1NSCs分化10天NF200、GFAP双标（AEC显色×400）（粗箭头示GFAP阳性细胞，细箭头示NF200阳性细胞）（略）

　　图2  A组8周，半切损伤部位为不闭合空洞（HE×40）（略）

　　图3  C组8周时移植部位生长情况，移植物与周围组织融合好，空洞基本闭合（HE×40）（略）

　　图4  A组移植4周，见移植物与宿主脊髓交界处可见大量增生密集的胶质细胞，形成带状再生纤维较少并排列紊乱（Holmes银染×100）（略）

　　图5  B组4周时移植物与宿主脊髓间分界较明显，两者间建立的神经纤维联系少（Holmes银染  ×100）（略）

　　图6  C组移植4周时移植物与宿主脊髓交界处有大量再生的神经纤维，排列规则（Holmes银染  ×100）（略）

　　图7  C组4周时移植部位神经干细胞分化出的典型的新生神经元（箭头所示；Holmes银染  ×400）（略）

　　表1  术后各组MEP和SEP峰潜伏时（略）

　　与C组比较：aP﹤0.01，bP﹤0.05

　　讨论    　　神经干细胞的发现打破了神经元不能再生的传统观念，然而大量的研究发现，NSCs移植到体内主要分化为神经胶质细胞，不能分化出足量神经元满足损伤脊髓功能恢复的需要。此外脊髓损伤后胶质细胞的大量增生，形成胶质瘢痕，是导致神经纤维不能再生的物理屏障。以上两点成为制约NSCs移植治疗脊髓损伤的关键。    　　VPA作为抗惊厥、抗癫痫和稳定情绪的一线药物，已在临床广泛应用近40年，近年的研究发现VPA在体外细胞培养中有抗细胞凋亡、促进NSCs向神经元分化，抑制向神经胶质细胞分化的作用［1］。有研究者发现，在NSCs培养液中加入0.1mmol/L VPA，可使大鼠皮层来源的神经元数量与对照组相比增加5倍，神经元的生长锥膨大，星形胶质细胞数量下降［2，3］。本实验将NSCs和VPA联合应用于脊髓损伤的修复，通过HE染色，观察到A组损伤部位形成了不能闭合的空洞，而其余两组空洞闭合情况较好。这与A组缺乏吸收性明胶海绵填充，周围组织塌陷有关。Homels染色主要用于观察神经纤维的生长排列，在该部分实验中我们发现，A、B组移植部位与宿主脊髓交界处生成了大量胶质瘢痕，再生神经纤维少，而C组交界处再生神经纤维多，排列比较有序，没有明显的胶质反应带和瘢痕形成，移植物和周围宿主脊髓组织之间能建立起较广泛的神经纤维联系。这种现象与VPA可抑制核因子κB（NFκB）的活性、炎症反应基因的表达以及小胶质细胞的活性和数量有关［4，5］，胶质细胞的减少和活性减低必然导致胶质瘢痕的减少，并且VPA还能够激活上调CAMP反应无件蛋白（CREB）活性［6］，增加细胞内环磷腺苷酸（cAMP）的水平，也减少了胶质瘢痕的形成［7］。VPA还能对抗脂多糖产生的神经毒作用，使神经元和胶质细胞内氧化作用降低，而且通过降低炎性因子的水平保护胺神经元［4］，促进神经元的生成。因此，我们在C组中观察到NSCs分化而来的神经元和排列有序的再生神经纤维多可能是上述因素综合作用的结果。    　　脊髓损伤后通常会发生MEP和SEP波峰峰潜伏时的改变［8］。本实验观察到各组在8周内波峰潜伏时改善趋势较明显；在各时相点，C组的各项指标显著优于其它组，其中以MEP的峰潜伏时表现出的差异最显著。这提示VPA与NSCs移植联合应用能够明显地促进损伤脊髓的功能修复，并且其运动功能的改善要优于感觉功能。究其原因可能有：一是VPA促进了NSCs向神经元分化，并且可能更倾向于分化为运动神经元，从而形成运动恢复优于感觉恢复的状况；二是相对于运动反射，感觉更需要在中枢的整合，路径更复杂，参与神经元更多，因而更不容易恢复。许多研究者认为，脊髓损伤后MEP的潜伏期有瞬时改变，而且短时间内不能恢复，而SEP的变化并不大，且MEP的波形也更加清晰和容易判断，能直接反应脊髓的运动传导束的功能，在评估运动功能的恢复中有重要参考意义［9，10］。    　　综上所述，VPA通过促NSCs向神经元分化和减少胶质瘢痕形成的作用，促进了损伤脊髓结构的修复，由此促进了功能的恢复，两者联合应用的治疗效果优于单纯NSCs移植，但该作用的分子机制还有待于进一步研究。