腹部肠管火器伤后肝组织COX2的表达与内毒素血症的关系

 作者：刘江伟，吕月涛，薛会朝，张永久，冯德元 ，许永华，李建英   

作者单位：（兰州军区乌鲁木齐总医院肝胆外科，新疆 乌鲁木齐 830000；兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验中心，新疆 乌鲁木齐 830000）

 【摘要】  目的 探讨环氧化酶2（COX2）在腹部肠管火器伤后肝组织中表达的变化及其与肠源性内毒素血症的关系。方法 健康长白仔猪42头随机等分为对照组和伤后1、2、4、8、12、24小时组，实验组建立腹部火器伤肠管穿透模型后，用显色基质鲎试剂法检测各组血浆内毒素水平；免疫组化图像分析法测定各组肝组织COX2的表达，同时测定血清中谷丙转氨酶（ALT）水平。结果 伤后各组血浆内毒素水平、肝组织COX2的表达及血清ALT水平均明显高于对照组（P＜0.05）。血浆内毒素水平于伤后8小时出现高峰，伤后12小时仍维持在高峰值水平；肝组织COX2的表达及血清ALT水平均于伤后2小时和12小时出现2个高峰。相关分析表明，伤后肝组织COX2与血浆内毒素及血清ALT水平均呈正相关（r值分别为0.718、0.850，P<0.05）。结论 腹部肠管火器伤后COX2的表达与内毒素血症密切相关，COX2在腹部肠管火器伤继发性肝损伤中可能起重要作用。

【关键词】  环氧化酶2；内毒素；腹部损伤；火器伤；肝损伤

　　Relationship between expressions of hepatic COX2 and intestinal endotoxemia after intestinal firearm wound

　　LIU Jiangwei,LU Yuetao,XUE Huichao,et al.

　　(Department of Hepatobiliary Surgery,Urumuqi General Hospital of Lanzhou Military Command, PLA,Urumuqi  830000,China)    　　Abstract:  Objective  To investigate the changes of expressions of hepatic COX2 and the relationship between hepatic COX2 and intestinal endotoxemia after intestinal firearm wound.Methods  A total of 42 ChangBai piglets were randomized into 7 groups: control group and wounded 1,2,4,8,12,24 hour groups.The models of intestinal firearm wound were established in wounded groups.Levels of plasma endotoxin was measured by using chromogenic limulus amebocyte lysate test;Hepatic COX2 expression were measured with immunohistochemical staining and image analysis in all groups.Levels of serum ALT were determined.Results  Levels of plasma endotoxin, hepatic COX2 expressions,serum ALT in wounded groups were all significantly elevated compared to control group(P<0.05).Plasma endotoxin reached the peak in 8h group,and it was still at the peak level in 12h group;Expressions of both hepatic COX2 and serum ALT appeared two peaks in 2h group and 12h group.In addition,the level of hepatic COX2 was positively correlated with plasma endotoxin and serum ALT(r=0.718 and 0.850,P<0.05).Conclusion  After intestinal firearm wound,the expressions of hepatic COX2 intimately correlated with endotoxemia,COX2 may play an important role in subsequent liver injury after the firearm wound.    　　Key words:cycloxygenase2;endotoxin;abdominal injuries;firearm wound;liver injury    　　在严重创伤打击下，机体肠道屏障功能破坏可引起肠道细菌移位、内毒素血症的发生，进而可诱发多器官损伤［1］，由内毒素刺激产生的多种炎症因子在创伤后多器官功能障碍综合征（MODS）的发生发展中起重要作用。环氧化酶2（cycloxygenase2，COX2）为一种“诱导型酶”，主要在炎症细胞中表达，与疼痛、发热、肿瘤及损伤等关系密切。近年来研究表明，COX2与肝损伤关系密切［2］。本研究在我们已经建立的腹部肠管火器伤模型的基础上［3］，观察伤后肝组织COX2表达、肝功能及内毒素变化，探讨COX2在腹部火器伤后继发性肝损伤中的作用及其与肠源性内毒素血症的关系。

材料与方法

　　1  实验动物及分组    　　选用解放军63650部队提供的健康长白仔猪42头，2～3月龄，体重27～33kg，平均（31.2±1.4）kg，雌雄不限。实验动物被随机分为7组：对照组和伤后1、2、4、8、12、24小时组，每组6头。

　　2  腹部火器伤模型［3］    　　枪伤前动物常规禁食12小时，自由饮水。5%盐酸氯胺酮注射液20mg/kg+0.05%硫酸阿托品注射液0.04mg/kg对猪耳后肌肉注射麻醉后，将猪行走位悬吊于戈壁军用靶场门廊上，四肢自然下垂，完全暴露腹部，于脐水平后方2cm处右侧腹壁皱襞下缘无毛区标记射击点。采用军用54式手枪，7.62mm手枪弹，经专业机构校准：子弹出膛初速度430～435m/s，弹丸重量5.5g，撞击能量508.48～520.37J，专业射手用手枪距猪侧腹壁30cm处瞄准射击点，从右侧腹壁垂直射入，左侧对应位置射出弹头。伤后15分钟内运回动物实验室，常温及动物实验室环境：温度22～24℃，相对湿度50%～60%。对照组除不致伤外，其余步骤与致伤组相同。

　　3  标本采集    　　实验各组分别于伤后1、2、4、8、12、24小时各时间点用无热原注射器抽取猪耳缘静脉血，对照组回实验室后立即抽血，一部分置入无热原肝素抗凝试管，离心提取血浆，置入无热原试管-80℃保存用于内毒素检测，一部分置入肝生化负压储血管，用于ALT检测。对照组抽血后立即开腹，实验组回实验室后于相应时间点抽血后麻醉开腹，每组动物均取肝左中叶下段肝组织，10%中性甲醛固定。

　　4  免疫组化图像分析法检测COX2的表达    　　COX2抗体为福州迈新公司产品（工作浓度1：100），按SABC法免疫组化试剂盒说明书操作。0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。用Imagepro Plus5.0医学图像分析软件检测每组细胞阳性染色的累积光密度值，用来表示COX2表达相对量。每张切片随机选取5个不重叠的高倍镜视野分析，分析过程中所有切片的放大倍数（×400）光源强度均相同。

　　5  肝脏血清酶学测定    　　取血静置30分钟后离心，东芝全自动生化分析仪(TBA40FR)测血清ALT水平。

　　6  血浆内毒素测定    　　显色基质鲎试剂试管法测定内毒素含量，操作按说明书进行。所用试剂为厦门鲎试剂厂产品。

　　7  统计学处理    　　实验数据以±s表示，用 SPSS13.0行单因素方差分析，LSDt检验进行两两比较，两变量相关分析用Pearson直线相关分析，检验水准α=0.05。

　　结果

　　1  动物存活情况    　　对照组和伤后1、2、4、12小时组动物全部存活，伤后8、24小时组各死亡1头。

　　2  剖腹探查    　　各组动物于伤后相应时间点开腹，探查均未见活动性出血及实质脏器破裂，腹腔内有约50～300ml淡黄色、淡红色至红色血性渗液，原发伤道区多发小肠穿孔破裂2～9处，伴或不伴有小肠边缘系膜破裂，结肠0～3处穿孔或破裂，表面附有粪便等肠内容物或伴有脓苔、血肿，穿孔肠壁外翻、部分坏死。腹压较高、臭味明显，腹膜炎较重。各组肠穿孔的平均数经方差分析无统计学差异，可认为各组伤情一致。

　　3  肝组织COX2表达的变化     　　COX2的阳性表达以肝细胞、枯否细胞、血管内皮细胞和胆管内皮细胞为主，黄色或棕黄色颗粒主要位于胞浆内,少数位于核膜（图1a）。对照组仅见少量肝细胞阳性表达（图1b），火器伤后肝组织COX2表达明显增强。用医学图像分析系统检测各组肝组织COX2的表达，经统计学处理，伤后各组肝组织COX2的表达均明显高于对照组(P＜0.05)，并于伤后2小时和12小时出现2个高峰，第2个高峰值＞第1个高峰值(P＜0.05)（见表1）。

a.伤后24小时              b.对照组

　　图1  COX2在肝组织中的表达（SABC ×400）（略）

　　4  血清转氨酶的变化    　　伤后各组血清ALT水平均高于对照组(P＜0.05)，并于伤后2小时和12小时出现2个高峰，第2个高峰值＞第1个高峰值(P＜0.05)（见表1）。

　　5  血浆内毒素的变化    　　实验组各组的血浆内毒素水平均高于对照组(P＜0.05)，并于伤后8小时达到高峰，伤后12小时仍维持在高峰值水平（P<0.05）,伤后24小时血浆内毒素水平虽然有所下降但仍明显高于对照组（P<0.05）（见表1）。

　　6  相关性分析    　　相关分析表明，伤后肝组织COX2的表达与血浆内毒素及血清ALT水平均呈正相关，相关系数分别为0.718、0.850，P<0.05。

　　表1  肝脏COX2的表达及血浆内毒素、血清ALT水平的变化（略）

　　与实验组各组比较：aP＜0.05；与本组前一时间点比较：bP＜0.05

　　讨论    　　肠道是机体最大的细菌和内毒素贮库，被认为是MODS始动器官，在创伤和感染等应激情况下，肠道的屏障功能受到削弱或损害，可使大量细菌和内毒素经由门静脉和肠系膜淋巴系统侵入血液循环，造成肠源性内毒素血症和细菌移位［4］。    　　本实验发现，伤后1小时开始血浆内毒素水平即明显升高，于伤后8小时达到高峰水平，伤后12小时仍维持在高峰值水平（P<0.05），伤后24小时血浆内毒素水平虽然有所下降但仍明显高于对照组（P<0.05），说明腹部肠管火器伤后即有大量内毒素入血，形成内毒素血症。伤后导致内毒素血症的原因为：（1）枪弹直接造成动物肠穿孔、肠坏死严重破坏肠道的屏障功能；（2）肠道内细菌和外界环境中的细菌经肠穿孔和局部伤道进入腹腔大量繁殖；（3）枪弹远达效应可以直接造成肝脏的急性损伤［5］，导致肝脏清除内毒素能力下降。内毒素化学成分为脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），LPS具有广泛的生物活性，可导致全身各器官的损害，肝脏是清除内毒素的主要器官，同时也是内毒素血症时最易受损的器官之一。LPS不仅可通过肝细胞膜特异性受体介导及非特异性胞膜结合两种方式进入肝细胞内，直接损伤肝细胞，更重要的还可与肝内非实质细胞（主要是Kupffer细胞）细胞膜上的特异受体CD14及Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)结合，激活这些细胞后通过多条信号转导通路诱导细胞内多种炎性介质大量生成［6］，组成复杂炎症网络造成肝细胞损伤。    　　COX2是一种诱导型酶，当细胞受到炎症等刺激时可高表达，是炎症介导的细胞毒性重要的决定因素之一，近年来研究证实，COX2在各种形式的肝损伤肝组织中表达均明显升高，在肝损伤的发生、发展过程中起重要作用［7-9］。本实验证实，腹部肠管火器伤后肝组织COX2表达明显增强，并于伤后2小时和12小时出现2个高峰，第2个高峰值＞第1个高峰值(P＜0.05)。考虑伤后2小时高峰可能与急性创伤有关，伤后12小时高峰的形成主要与伤后腹腔感染所致内毒素血症的形成有关。LPS可以诱导肝细胞多种炎症相关因子的表达［10］，是诱导COX2的主要因素之一。相关分析表明，伤后肝组织COX2与血浆内毒素水平呈正相关，相关系数为0.718，（P<0.05）。可见腹部肠管火器伤后内毒素血症对肝组织COX2表达具有重要影响。    　　伤后肝组织COX2与血清ALT水平均呈正相关，相关系数为0.850，P<0.05，并且肝组织COX2逐渐升高的趋势与肝脏功能损害逐渐加重趋势基本一致，可见COX-2在腹部肠管火器伤后继发性肝损伤中起重要作用。    　　综上所述，腹部肠管火器伤后可导致肝组织COX2高表达，COX2参与了火器伤后继发性肝损伤的形成，内毒素血症可能在诱导肝组织COX2的产生中起重要作用。这为我们深入探讨腹部肠管火器伤后继发性肝损伤的发生机制提供了实验依据。

【参考文献】  　　［1］姚咏明，董胜利，于勇，等.创伤后肠道细菌/内毒素移位的发病机制与意义［J］.世界感染杂志，2004，4(5)：433-437．

　　［2］吕月涛，刘江伟，冯德元，等.环氧化酶2与肝损伤［J］.中国现代普通外科进展，2007，10（4）：341-343.

　　［3］刘江伟，张永久，李泽信,等.常温和干热环境下腹部肠管火器伤动物模型的建立［J］.创伤外科杂志,2007,9(5)：408-410．

　　［4］盛新华，石汉平.肠道在多器官功能障碍综合征中的作用［J］.世界华人消化杂志，2005，13（16）：2029-2032.

　　［5］张永久，刘江伟，李泽信，等.常温环境下腹部火器伤肠管穿透后猪肝脏功能和形态的变化［J］.西北国防医学杂志，2007，28（4）：254-256.

　　［6］Scott MJ,Liu S,Su GL,et al. Hepatocytes enhance effects of lipopolysaccharide on liver nonparenchymal cells through close cell interactions［J］.Shock,2005,23 (5):453-458.

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　　［8］Nanji AA.Role of Kupffer cells in alcoholic hepatitis［J］.Alcohol,2002,27(1):13-15.

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　　［10］Spitzer JA,Zheng M,Kolls JK,et al.Ethanol and LPS modulate NFkappaB activation, inducible NO synthase and COX2 gene expression in rat liver cells in vivo［J］.Front Biosci,2002,7:99-108.