颅脑损伤动物模型的制备及评价

作者：梁楠，王仙凤，张晓    作者单位：(成都医学院实验技术中心，四川 成都 610083；成都医学院04级临床本科班，四川 成都 610083)

【摘要】  颅脑损伤是医学界面临的难题和研究热点之一。颅脑损伤动物模型的制备对颅脑损伤相关基础研究具有重要意义。笔者就目前国内外常用的颅脑损伤动物模型的制备及评价的方法作一综述。

【关键词】  颅脑损伤；动物模型；功能评价

　　Establishment of brain injury models and its evaluation after brain injury

　　LIANG Nan，WANG Xianfeng，ZHANG Xiao

　　（Chengdu Medical College，Chengdu  610083，China)    　　Abstract：  Brain injury is one of the most difficult problems as well as the hot topics in medical researches at present．The establishment of animal models of brain injury is of great importance to fundamental researches in this field．The author now gives a general review on the latest experimental processes of establishing animal models of brain injury and the methods of evaluation after brain injury both at home and abroad．    　　Key words：brain injury；animal model；evaluation    　　目前，从事脑部研究的大量学者和医务工作者都在致力于寻找与人类脑损伤(Brain injury)状态相似的动物模型。由于动物与人类的脑系统存在差异，因而选用合适的模型制备及评价方法显得尤为重要。

　　1  脑损伤动物模型的制备

　　1.1  颅脑爆炸伤模型  颅脑爆炸伤模型对研究现代战争中各种爆炸性武器爆炸后产生的弹片和碎片所致脑损伤具有重要价值。Axelsson等［1］2000年用猪进行颅脑爆炸伤实验。他们观察到动物脑损伤后均出现呼吸暂停、心率减慢、平均动脉压降低等脑干抑制现象。这些特征性的病理生理变化是由于爆炸冲击波直接作用于动物头颅，使脑干及更高级的控制中枢受到损伤所致。犬颅脑爆炸伤其模型［2］制作方法为:用电雷管与导爆索相连接，实验时以干电池引爆电雷管，通过导爆索从爆炸源球心起爆。引爆时将爆炸球分别悬于距致伤动物右颞顶部不同但适当距离处。且采用点爆炸源对犬的右颞顶部进行不同距离的爆炸。点爆炸源装药量稳定，爆炸参数明确，爆炸能量可控制；球形炸药以柔性导爆索传爆，起爆点位于炸药中心的柔性导爆索末端,产生的冲击波为球形，压力场分布为各向同性，接近爆炸性武器产生的冲击波；爆炸时火药完全燃烧不产生碎片，无爆炸残余物，能较真实地模拟爆炸时的原发效应。该模型成功地屏蔽了其他因素的干扰，致伤因素单纯，且其最大的优点是可以通过调整炸药球的装药量(炸药能量)或调节动物与致伤物距离(致伤能量)来模拟不同程度的颅脑爆炸伤损伤。

　　1.2  改良Marmarou法建立直线加速型颅脑损伤模型  该模型的制作［3］采用改进的Marmarou致伤模具，将大鼠俯卧于泡沫垫上，纵行切开头皮，暴露颅骨穹隆。颅骨顶表面冠状缝与人字缝间固定1枚铁制圆盘(直径10mm，厚3mm)，其底呈弯弧状，与颅顶相吻合，于Plexiglas落体管下，由管内重物坠落撞击铁盘，致头颅受力引起颅脑损伤。由于泡沫垫的存在，头颅受力后能沿重力方向产生一定的缓冲性加速，以确保外力作用的瞬时性，这是该模型不同于自由落体模型的关键。而铁制圆盘又保证了外力作用的弥漫性，因此减轻了外力打击对头颅局部的接触效应，较大范围地增强了外力打击对头颅的惯性效应。外力负荷的这种瞬时性和弥漫性特征，决定了这一实验模型决不是一般意义上的自由落体打击模型，而是一种垂直面上的打击直线加速颅脑损伤模型。该颅脑损伤模型模拟了闭合性直线加速颅脑损伤，经致伤后脑组织冰冻切片病理学观察：蛛网膜下腔、脑室内广泛出血，额顶区的皮质内存在以皱缩样变性为特征的神经元改变及轴索肿胀回缩球。这与1994年Marmarou和Foda的描述相符［4］。证实这一头颅打击直线加速模型与人类头颅受到钝性、非穿透性打击后的脑内变化极为相似。

1.3  缺血性颅脑损伤模型  血管缺血性颅脑损伤是由于各种原因诱发脑血管栓塞引起脑组织缺血、低氧，进一步诱发脑神经细胞变性、坏死，最终导致神经功能障碍丧失的一类疾病，其死亡率和致残率都较高，严重威胁人类健康［5］。缺血性颅脑损伤模型具体制作方法为［6］：猴用氯胺酮肌注麻醉后，剪去左侧腹股沟区的毛，按常规消毒，并用洞巾覆盖未经消毒处理部位。行左侧股动脉穿刺时，取右腹股沟韧带下1.5cm左右股动脉搏动最强点为穿刺点，采用改良Seldinger法穿刺右股动脉，置人短导丝，以5F扩张器及导管鞘扩张，然后置人5F导管鞘。用5F猎人头导管插入至主动脉弓，造影观察各主要分支走行，再选择进入至左头臂干并行DSA造影检查，然后将5F猎人头导管选择进入至颈总动脉，再选择至左侧颈外动脉和右颈内动脉行数字减影血管造影（DSA）检查，在交换导丝的导引下,置换入6F引导管，至大脑中动脉，注入5粒直径lmm大小的聚乙烯醇（PVA），血管造影显示血管阻塞区域及面积。确认血管阻塞及缺血后，通过外周静脉输入甘露醇脱水，静脉滴注抗生素防止感染。用该方法复制出的猴颅脑损伤模型的病变特点与临床表现一致，模型稳定可靠，适用于急慢性治疗研究和相关基础理论研究。2007年有学者［7］制作了幼鼠缺血低氧模型。他们试图通过MRI来量化梗死灶的大小。模型制作的具体方法为：将幼鼠在密闭容器中吸入麻醉后行颈部正中切口，结扎幼鼠单侧劲总动脉。后将鼠放入34℃保温箱中观察10～15分钟，待其恢复正常活动后将其放回母鼠处哺育2小时。随后将幼鼠放在一个室温为34℃的有8% O2/92% N2的低氧容器内并维持2小时，之后行MRI操作。

　　1.4  放射性颅脑损伤模型  放射性颅脑损伤鼠模型的建立有麻醉状态和清醒状态两种情况下进行。麻醉状态［8］：将实验动物麻醉后，俯卧固定于60CO治疗机治疗床，在一定的源皮距下照射。放射疗程中每日观察大鼠摄食、饮水量及次数，自主活动情况，有无出现神经系统症状与体征。每周检查并记录大鼠头部照射区毛发与皮肤情况、体质量变化，照射结束后一定时间内断头取脑，行病理组织学检查。提示照射后脑组织的损伤程度与放射后观察时间及放射累积剂量的增加有关。该方法能较好地模拟放射性颅脑损伤过程，成功地建立大鼠急性放射性颅脑损伤动物模型，为研究放射性脑病的发病机制及治疗提供了基础。清醒状态: 王琛等［9］用“热记忆膜固定罩”建立在清醒状态下大鼠放射性脑损伤实验模型。“热记忆膜固定罩”使动物在清醒状态下接受全脑照射，用剂量仪作吸收剂量测量。该方法操作简便，重复性好，照射剂量确实，有效地排除了麻醉药物对实验结果的干扰,且临床模拟性好，基本符合放射性颅脑损伤动物实验模型的理想条件，可用于早期放射性颅脑损伤与防护机制的研究。

　　1.5  脑冷冻伤模型建立  脑冷冻伤模型［10］是一种类似于人脑挫伤的动物模型，主要为血管源性脑水肿，是常用的颅脑损伤实验研究的模型。其制作方法为:在25℃下，将大鼠腹腔麻醉后，俯卧于手术台上，沿颅正中切口切开头部皮肤，分离左顶各层组织、颅骨骨膜，暴露出左侧顶骨，将-196℃液氮预冷的冷冻器(冷冻头呈圆形，直径为5mm)，垂直置于左侧顶骨以矢状缝旁开5mm为圆心的面上(冷冻头前缘至冠状缝)冷冻，造成左顶叶脑冷冻伤。实验中，冷冻处颅骨由白色恢复至周围组织同样颜色的时间，一般在8～10秒表示冷冻良好，缝合伤口，放回笼中让其自由进食进水。结果液氮作用后2小时，脑组织已出现充血、水肿及神经元坏死的表现，并于12小时明显累及海马回神经元，有价值的是，与坏死交界处的健在神经元呈现了B细胞淋巴瘤/白细胞2（Bcl2）的高表达。

　　2  颅脑损伤动物的评价    　　动物颅脑损伤后的评定主要有神经功能评价、运动功能评价和组织形态学评价，研究者发现应把三者结合起来确定脑损伤程度、观察恢复情况及评价疗效。

　2.1  神经系统检查  用氮气或戊巴比妥纳对动物进行缺血低氧处理24小时前后将其放入四面透明的树脂玻璃容器内(47cm×25cm×15cm)，通过对其进行从身体姿势、皮肤颜色、握力、角膜反射等28个项目评分测定其神经功能，具体的检测项目，顺序及评分标准可参见文献［11］。第1次评定后所得到的总分将作为基线结果并被标准化到百分之百。

　　2.2  神经功能缺失评定  具体的评分标准［12］：0分为没有可见的神经功能缺失；1分为对侧前后肢不能完全伸直；2分为行走时向对侧(左)倾抖但休息时姿势正常；3分为意识障碍；4分为无自发的行为活动。

　　2.3  Treadmill法［13］也叫踏旋器法，让颅脑损伤的大鼠以后肢和臀部坐在一装有传感器的平台上，通过检测后肢与臀部对平台的切应力可测出大鼠的平衡功能 。

　　2.4  钉板平衡木行走测试(Pegged Beam Walking Test)  评估前后肢的精细运动功能和两侧肢体的协调性。将4个钉子(直径2mm、高3cm)均等分布于宽2.5cm、长120cm、高69cm的平衡木上做成钉板平衡木。利用大鼠避光趋暗的天性，在钉板平衡木尽端置一黑箱，观测大鼠行走时受损后爪从钉板平衡木上滑落脚步的次数(footslips)［14］。

　　2.5  组织学形态评价  研究者主要采用取脑组织行HE染色或尼氏染色法，观察损伤后脑组织病理变化。免疫组织化学Bcl2表达评价［15］：健侧大脑皮质Bcl2的表达阴性，而冷冻伤侧神经元则呈现阳性表达，阳性细胞分布主要位于变性、坏死与正常组织交界处。现在我们也可采用细胞凋亡蛋白酶3（CPP3）方法［13］将从石蜡包埋的冠状脑部分取得的连续切片在二甲苯中脱去石蜡并且在不同浓度的酒精中脱水。在内生过氧化物酶的活性在过氧化氢中阻断之后，将切片放在盛有0.01mol/L的柠檬酸盐容器中用微波炉中加热20分钟。将切片放入湿盒内，用细胞凋亡蛋白酶3多克隆抗体在室温下孵育1小时，然后使用亲和-生物素复合物免疫过氧化物酶技术染色。后用Mayer's苏木精和封固剂，最后在显微镜下观察切片的病理组织改变。TUNEL(terminal deoxynucleotidyltransferase mediated dUTP nickend labeling)方法［16］：为了研究神经元的DNA片断，将从石蜡包埋的冠状脑部分取得的连续切片在脱石蜡和再水化之后，将切片用蛋白本酶K在室温下预先处理15分钟，之后用2%过氧化氢灭活内生过氧化物酶的活性。将切片放在TdT缓冲液内在保湿室内37℃下孵育60分钟。最后，抗生物素蛋白链菌素-生物素-过氧化物酶合成物二氨基联苯、TUNEL标记的载波片用1%甲基绿复染，最后在显微镜下观察切片的病理组织改变。

　　3  展望    　　在现实生活中颅脑损伤的发生多有不可预见性，因此颅脑损伤模型的基本要求是具有较好的可调控性：即可根据实际需要调整损伤强度，制作出不同损伤程度的脑损伤模型；可操作性与可重复性，即对脑损伤模型制作的各关键步骤客观化、定量化，使其可信度高、可实施性强，能反映客观问题且损伤机制与临床实际相接近。

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　　［2］高波,贺世明,王占江，等.新型犬颅脑爆炸伤模型的建立［J］.解放军医学杂志，2007，32（2）:164-166.

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