创伤性脑损伤后脑组织c

作者：杭春华,史继新,吴伟,印红  【关键词】  脑损伤；基因；细胞凋亡；神经细胞

　　摘要：  目的  研究创伤性脑损伤(TBI)后脑组织cfos表达及神经细胞凋亡，探讨神经细胞凋亡在脑继发性损害中的作用，及cfos基因表达与凋亡的关系。方法  雄性Wistar大鼠，随机分为假手术对照组和脑创伤后3、12、24、72小时和7天组，采用自由落体撞击致重型颅脑损伤。应用TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组化法观测cfos的表达。结果  TBI后3小时创伤组各组脑组织即出现cfos表达和神经细胞凋亡，随伤后时间逐渐增强，至伤后72小时达高峰，伤后7天仍有明显的cfos表达和神经细胞凋亡。其分布区域为脑挫伤区、挫伤周围皮质和海马，累及细胞类型包括神经元和胶质细胞。cfos表达与神经细胞凋亡在时序空间分布上基本一致，两者呈正相关。结论  创伤性脑损伤可引起脑组织明显的cfos表达和神经细胞凋亡，cfos表达增加在神经细胞凋亡和修复中可能起重要作用。

　　关键词：脑损伤；基因；细胞凋亡；神经细胞

　　Cfos expression and apoptosis after traumatic brain injury

　　HANG Chunhua,SHI Jixin,WU Wei,et al.

　　（Department of Neurosurgery;Nanjing General Hospital of Nanjing Command,Nanjing  210002,China）

　　Abstract：  Objective  To study cfos expression and apoptosis after traumatic brain injury (TBI) in rats,and to explore the role of apoptosis in the secondary brain injury,and the relation between cfos expression and neuroglial apoptosis.Methods  Male Wistar rats were randomly divided into the control group and 3,12,24,72h and 7 day group after injury.Parietal brain contusion was made by weightdropping method.Apoptosis was detected by immunohistochemical staining（TUNEL）,and cfos expression was detected by immunohistochemistry.Results  cfos expression and apoptosis was found in the injury group 3h after TBI,which increased gradually at 12,24,72h and 7d after TBI.The involved cells included neurons and glial cells.cfos expression and neuroglial apoptosis appeared to be similar in temporal changes and spatial localization,with a high relation between these 2 variables.Conclusion  It is highly suggested that TBI could induce significant cfos expression and apoptosis after TBI,and cfos expression might be highly responsible for the apoptosis,proliferation and renovation after TBI.

　　Key words:brain injury;cfos;apoptosis;neuroglial cell    　　凋亡是有核细胞在一定条件下通过启动其内部机制,主要是内源性DNA内切酶的激活而发生的细胞自然死亡的过程。细胞凋亡的产生和发展受存活和死亡等众多基因的共同调控，如原位癌基因cfos和cjun［1］。本研究旨在探讨大鼠创伤性脑损伤（TBI）后神经细胞凋亡和cfos的变化规律,以进一步明确cfos基因表达与细胞凋亡的相关性、可能的作用机制及其在脑损伤中的意义。

　　材料与方法

　　1  创伤性脑损伤模型雄性Wistar成年大鼠购自上海中科院实验动物研究所，体重200~230g。动物随机分为：(1)对照组（6只），为假致伤，仅行右侧顶部骨窗而无脑损伤；(2)脑损伤组（30只），分别分为伤后3、12、24、72小时及7天组，每组6只。20%乌拉坦腹腔注射麻醉(1g/kg体重)，固定大鼠头部，头部备皮后碘酊消毒无菌手术，用牙科钻于大鼠颅骨冠状缝后缘、中线右侧开骨窗直径5mm，保持硬膜完整。按Feeney 自由落体撞击致伤方法，造成右顶叶脑挫裂伤，致伤直径4mm，深度5mm，打击能量1000g?cm，致重型颅脑损伤［2］。在挫伤区及其周围脑组织和海马采集标本，10%中性缓冲甲醛固定。对照组在假致伤后72小时处死采集标本，脑损伤组分别于相应的时间点处死采集标本。

　　2  cfos基因免疫组化观测兔抗cfos一抗购自武汉博士德生物科技公司，工作浓度为1∶200。免疫组化染色的切片行光镜检查，观察其染色强度，阳性细胞表现为棕褐色。在显微镜下观察连续10个高倍视野，计算平均每100个细胞中cfos蛋白阳性细胞数。

　　3  神经细胞凋亡检测应用原位细胞凋亡检测(TUNEL)法进行细胞凋亡的检测，按试剂盒(德国宝灵曼公司)说明书操作。在显微镜下凋亡细胞核呈棕黄色，观察连续10个高倍视野，以平均每100个细胞含凋亡细胞个数为凋亡指数(AI)。

　　4  统计学处理采用SPSS 11.0进行数据分析，每个变量表示为均数±标准差。统计学分析用ANOVA方差分析、Dunnett T3 post hoc检验，P<0.05为统计学差异显著。

　　结  果

　　1  脑组织cfos表达对照组仅见少量神经细胞表达cfos，位于细胞核和细胞质(图1a)。TBI后3 小时即出现较多的cfos阳性蛋白表达，但仅限于脑挫伤区，以胶质细胞为主；TBI后24小时在挫伤区周围皮质也出现较多的cfos阳性蛋白表达，于低倍镜下见损伤区及周围皮层和白质中有多量呈弥漫分布的阳性神经细胞，呈棕褐着色；高倍镜下见棕褐色cfos蛋白阳性产物均匀分布于细胞核,见于星形胶质细胞和神经元细胞(图1b，箭头所示为神经元细胞体)。TBI后72小时在挫伤区血管壁出现大量的cfos阳性细胞，包括血管内皮细胞、浸润的中性粒细胞和巨噬细胞(图1c)，同时，在海马区也出现大量cfos表达，主要位于神经元细胞核(图1d)。TBI后挫伤区及其周围脑组织的cfos表达逐渐增强，至伤后72小时达高峰，在伤后7天有所下降，但仍明显高于对照组(图2)。

　　图1  TBI后脑组织cfos表达　略

　　图2  TBI后脑组织cfos表达　略

　　2  脑组织的细胞凋亡 本实验结果显示，脑外伤后存在2种类型TUNEL阳性神经细胞。I型TUNEL细胞表现为胞浆红染，核着色淡，结构疏松，细胞肿胀明显，胞质无浓缩现象，胞核无固缩，符合坏死细胞特点，主要集中在致伤灶中心部位，片状分布，峰值时间为伤后12~24小时。Ⅱ型TUNEL细胞表现为圆形、皱缩的形态特点，核固缩，细胞着色深，胞核红染明显，符合凋亡神经细胞特点(图3，箭头所示)。Ⅱ型TUNEL神经细胞呈散在分布，相对集中于伤灶周边白质和海马。对照组仅有少量的神经细胞凋亡(图3a)，TBI后3小时脑挫伤区神经细胞凋亡即增加(图3b)，伤后24小时在挫伤周围脑组织也出现明显的神经细胞凋亡(图3c、d)，与对照组相比，伤后24小时的细胞凋亡明显增加(P<0.01,图4)，至伤后72小时达高峰，伤后7天仍有大量凋亡细胞存在(图4)。

3  cfos阳性表达与神经细胞凋亡的关系TBI后脑组织cfos表达与神经细胞凋亡在时间和空间分布上基本一致，均在伤后3小时有一定程度增加，至72小时达高峰，伤后7天仍维持在较高水平。通过Pearson相关系数计算,可见TBI后cfos阳性表达与TUNEL阳性表达存在明显正相关( r=0.737,P<0.0001)。   　　图3  TBI后神经细胞凋亡　略

　　图4  TBI后脑组织的凋亡指数　略

　　讨  论

　　本研究发现脑创伤后在挫伤区及其周围脑组织和海马存在cfos表达和神经细胞细胞凋亡现象，脑损伤后3小时即有cfos表达和TUNEL阳性染色的神经细胞出现，高峰出现在伤后72小时，伤后7天仍有明显的cfos表达和神经细胞凋亡。在过去的10多年间,凋亡在神经系统损伤中的作用逐渐为人们认识。1993年Tominaga等［3］首次证实缺血性脑损伤可引起神经细胞凋亡,Rink等［4］1995年发现大鼠脑外伤后伤侧皮质、白质、海马、齿状回等区域出现细胞凋亡。Conti等［5］发现在脑外伤后24小时和1周有2个凋亡高峰,除了神经元,少突胶质细胞和星形胶质细胞也参与了凋亡活动。Williams等［6］发现伤后12个月,在白质内仍能见到明显的凋亡细胞。上述证据说明细胞凋亡参与了脑外伤后神经细胞病理改变过程。脑外伤后坏死及凋亡神经细胞均出现TUNEL阳性染色，原因可能是神经细胞坏死过程中染色质裂解，小分子DNA游离进入细胞浆而被TUNEL染成红色，但两者超微结构明显不同。神经细胞凋亡与坏死的时序空间分布有明显不同，这种差异与细胞毒性物质作用强度、创伤能量分布及脑组织敏感性差异有关。创伤后神经细胞的早期死亡均为损伤直接导致的坏死,随后的细胞死亡则既有坏死也存在凋亡。研究证明，低浓度兴奋性氨基酸(EAA)长时间作用导致神经细胞凋亡，高浓度EAA则引起细胞坏死。脑外伤暴力直接作用的皮质神经细胞膜功能严重受损，膜电位逆转，跨膜离子转运功能丧失，线粒体呼吸功能被破坏，导致细胞内钙离子集聚，EAA大量生成，细胞肿胀坏死；外力打击相对较轻的伤灶周边部位，细胞处于相对静止状态，离子传递受到抑制，能量合成减少，细胞内钙离子缓慢升高，使内源性凋亡促进基因激活，进而发生细胞凋亡。另外，外伤后脑血流调节受损,大脑缺血缺氧,脑组织的缺血缺氧造成细胞能量代谢障碍以及兴奋性氨基酸过量释放、细胞内钙失衡、脂质过氧化物和自由基产生等变化，这些微环境的改变促使凋亡调控基因表达的上调或下降,最终启动了细胞自杀程序。细胞接受外界死亡信号后,经过一系列信号转导、基因致变、酶激活等复杂过程启动细胞自杀程序,使细胞发生凋亡。对凋亡相关基因调控的研究是了解细胞凋亡机制的根本。早期反应基因在接受外界信号刺激后迅速作出反应,它们的表达不需重新合成蛋白,而是由原有蛋白进行翻译后修饰来实现。这类基因包括cmyc、cfos和cjun,其蛋白产物位于细胞核,与DNA相结合,有转录因子AP1的活性,决定着其他基因的转录和表达。在凋亡过程中,这类基因是联系信号与凋亡发生的中介者。cfos基因是神经细胞中最常见的快速反应基因家族中的一员，在正常情况下不易被检测，参与细胞的生长、发育、分化、记忆和信息传递等过程。但在癫痫、脑缺血缺氧、创伤等刺激下，cfos基因早期表达增加，并与继发性病理过程如神经细胞凋亡有关［7］。国内外研究均证实,cfos基因的高表达与颅脑外伤后的神经细胞凋亡存在着密切关系［1,7］,其内在机制在于cfos基因的表达产物cfos蛋白由胞质转入核内，与cjun基因的蛋白产物cjun蛋白形成fosjun异源二聚体，作用于DNA的特殊序列,调节相关基因的转录,发挥第三信使的作用。而不适当的过度表达产物直接或间接地激活了细胞内的限制性核酸内切酶,干预细胞核的修复功能,从而引发了细胞的整个凋亡过程。有关研究表明,在颅脑外伤后cfos基因表达是外伤后局部神经细胞反应性的一种表现,在一定程度上代表了整个大脑损伤的情况。本实验也证实了在伤侧皮质局部cfos基因表达最为强烈；同时也观察到在对缺血较敏感的海马也有阳性表达,说明cfos蛋白主要介导了脑损伤后局部细胞凋亡的发生,并可能参与了海马迟发性神经元死亡,这为理解颅脑外伤后情绪、学习与记忆的变化提供一条新的思路。颅脑外伤后的细胞凋亡是一非常复杂过程,在外伤后继发性脑损害中占有很重要的角色,"创伤半暗带"内的细胞将成为研究重点,通过对“创伤半暗带”内神经元以及胶质细胞的凋亡调控将为治疗提供新的思路。目前对于创伤性神经细胞凋亡与坏死在时序空间分布上的差异，海马、齿状回易损性机制，凋亡调节基因非平衡表达的机制等诸多方面尚不清楚，有待进一步研究。随着有关创伤性神经细胞凋亡及相关调控基因的深入研究，无疑对颅脑损伤的临床治疗具有重要的理论指导意义。

　　参考文献：

　　［1］Raghupathi R,McIntosh TK.Regionally and temporally distinct patterns of induction of cfos,cjun and junB mRNAs following experimental brain injury in the rat［J］.Brain Res Mol Brain Res,1996，37(1-2):134-144.

　　［2］王清华，徐如祥，李良平，等.大鼠不同程度脑损伤模型的建立［J］.创伤外科杂志，2000，2(1):42-44.

　　［3］Tominaga T,Kure S,Narisawa K,et al.Endonuclease activation following focal ischemic injury in the rat brain［J］.Brain Res,1993，608(1):21-26.

　　［4］Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptosis cell death after experimental traumatic brain injury in the rat［J］.Am J Pathol,1995,147(6):1575-1583.

　　［5］Conti AC,Raghupathi R,Trojanowski JQ,et al.Experimental brain injury induces regionally distinct apoptosis during the acute and delayed posttraumatic period［J］.J Neurosci,1998,18(15) :5663-5672.

　　［6］Williams S,Raghupathi R,Mackinnon MA,et al.In situ DNA fragmentation occurs in white matter up to 12 months after head injury in man［J］.Acta Neuropathol,2001,102(6):581-590.

　　［7］Honkaniemi J,States BA,Weinstein PR,et al.Expression of zinc finger immediate early genes in rat brain after permanent middle cerebral artery occlusion［J］.J Cereb Blood Flow Metab,1997,17(6):636-646.

（南京军区南京总医院神经外科，江苏    南京  210002)