热休克蛋白70与脑损伤的关系

　　作者：曹峻华，邓世雄    作者单位：重庆医科大学法医学教研室，重庆 400016

　　【摘要】  热休克蛋白（HSP）70作为一种重要的应激蛋白，与脑损伤密切相关，对神经损伤具有保护作用。本文就HSP70的生物学特性及其与脑损伤的关系作一综述。

　　【关键词】  热休克蛋白 脑损伤

　　Heat shock protein 70 and brain injury

　　CAO Junhua，DENG Shixiong

　　Department of Forensic Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing  400016,China

　　Abstract:  Heat shock protein 70 is an important stress protein that is closely associated with brain injury for its protective effects on nerve injury.This article reviews the biological characters of heat shock protein 70 and its relation of brain injury.

　　Key words:heat shock protein;brain injury   　　细胞在高温和其它许多应激刺激（如损伤、缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病原体感染等）作用后，可以抑制一些正常蛋白质的合成，同时启动一类新的蛋白质合成，因最先发现其在热休克诱导的果蝇染色体中合成，故被命名为热休克蛋白（heat shock protein，HSP）。其中HSP70家族是HSP中最保守和最主要的一类，在大多数生物中含量最多，在细胞应激后生成最为显著，因此HSP70成为热休克蛋白中最受关注，研究最深入的一种。

　　1  HSP70的生物学特性

　　1.1  HSP70的表达与调控

　　HSP70的表达机制至今尚未完全清楚，但是研究表明均与热休克转录因子(heat shock transcription factor，HSTF)和热休克元件（heat shock element,HSE）有关。Munro等［1］认为，HSTF的作用与泛素(Ub)非依赖性溶酶体蛋白降解系统密切相关。正常情况下HSTF以无活性的单体形式呈泛素化状态。在应激状态下，细胞内产生大量变性蛋白，激活Ub介导的蛋白降解系统，游离的Ub水平下降，与HSTF的结合减少，致游离态单体HSTF增多，且3个单体HSTF结合成1个有活性的三聚体，亲和性明显加强，并与HSE结合，在RNA 聚合酶作用下促进HSP基因转录及表达。伴随着变性蛋白大量被水解酶降解，加之细胞不断合成新的Ub，HSTF则因重新Ub化而失活，从而停止基因转录。Larson和Marcuccilli等［2，3］认为在非应激状况下，HSP70结合HSTF，抑制HSTF活性，HSTF与HSE有低水平结合。热休克时，细胞内大量增加的非稳定蛋白、变异蛋白以及新生和转移蛋白前体与HSP70的高亲合力结合，使游离HSTF增加，HSTF单体发生三聚体构型改变，活性增加。HSTF三聚体与HSE快速高水平结合，保证HSP基因高效转录，HSP70蛋白的合成增多，直至HSP70的水平足够结合HSTF，使其活性降低，从而关闭热休克基因的表达。而Zou等［4］则认为，是HSP90与HSTF在平时结合成复合体抑制了HSTF活性，变性蛋白与HSP90结合后，使HSTF释放出来并继续下面的过程。

　　1.2  HSP70的生物学功能

　　通常认为HSP70可提高细胞对各种损伤因子的耐受能力，起保护细胞结构和功能的作用。其主要作用有以下几个方面：（1）分子伴侣（molecular chaperone）作用。HSP70是最重要的伴侣蛋白之一，能与蛋白分子结合，保护新合成的蛋白分子的构型，辅助蛋白分子在细胞内跨膜转运，参与蛋白质的折叠、伸展及多聚复合体的组装；当蛋白质受损变性时，能促使其恢复或加速其降解和清除，以维护细胞的功能［5］。HSP70作为"分子伴侣"调节靶蛋白的活性和功能，但不参与靶蛋白的组成［6］。（2）提高细胞耐热性作用。预先给予细胞以非致死性热处理，可提高细胞对随后致死性热处理的存活率，这种现象称为热耐受(thermotolerance) 。热耐受的产生与HSP70有关。当热应激刺激诱导细胞产生HSP后，不仅使细胞对该刺激的耐受性增加，同时也增加了细胞对其他应激原刺激的耐受性［7］，此现象称为交叉耐受性。（3）结构功能。HSP70与HSP90共同参与构成人体细胞（包括单核巨噬细胞）表面的登革热病毒受体复合物,且所有的HSP均与登革热感染细胞表面的脂质筏（lipid rafts）有关［8］。（4）细胞因子样作用。HSP70与单核细胞膜有高度亲和力，当把HSP70作用于单核细胞时，细胞内的钙离子快速外流，并激活核因子κB以及促使致炎因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素1β（IL1β）、白细胞介素6（IL6）上调。HSP70能激活两条不同的信号途径：依赖于CD14辅助受体（covecepter）和钙离子的信号途径能使TNF、IL1、IL6上调，不依赖于CD14辅助受体的途径仅能使TNF上调。这提示HSP70作为一种细胞外蛋白对人单核细胞的功能起细胞因子样的调节作用［9］。

　　2  HSP70与脑损伤

　　2.1  HSP70在脑损伤中的表达  　　HSP70的表达部位与脑损伤程度有关。Kanayama等［10］对创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）大鼠的脑组织研究发现：轻微脑损伤(1.0atm)在损伤部位没有神经元的缺失，伤后1小时损伤部位皮质表层的HSP70免疫反应性显著增高；在重度脑损伤(4.3atm)虽然在损伤部位有神经元的明显缺失，但是HSP70的免疫反应性却仅于伤后6小时在坏死区域下方的深层皮质层中度增高。Allen等［11］对小脑局灶性砸伤的大鼠的研究发现，在重度砸伤后，HSP70主要集中表达于创伤区域的颗粒细胞和同侧深部小脑核；轻度砸伤，HSP70则仅表达于颗粒细胞层。而在小鼠闭合性颅脑损伤模型上，HSP70 mRNA水平仅在大脑皮层短暂性增高，峰值则出现在伤后1小时（6倍于对照组）［12］。由此可以看出，脑损伤程度越重，HSP70表达的部位越深。

　　HSP70的表达部位、时间与脑损伤类型、是否有继发性损伤有关。大鼠脑部液体冲压伤(2.2～2.4atm)后2小时，HSP70  mRNA的表达局限于挫伤区域的周围皮质；伤后6小时，HSP70 mRNA在深部皮质层、上部皮质层和最大损伤区域的皮质下白质中持续表达；伤后24小时，大脑所有区域的HSP70 mRNA均降至与对照组相当的水平。伤后6～24小时，损伤的皮质可见HSP70阳性表达，HSP70表达最明显则出现在伤后48小时的损伤皮质的Ⅱ、Ⅲ层［13］。在伴随有继发性低氧、轻度低血压的控制性皮质撞击损伤（controlled cortical impact，CCI）模型上，受伤同侧皮质的神经元、海马CA3区、齿状回于伤后6小时才有HSP70 mRNA表达，HSP70 mRNA主要于伤后24小时的损伤侧皮质表达。而在伤后72小时则下降至接近基线水平。HSP70于伤后24小时开始在损伤侧皮质的神经元、海马CA3区中间层（CA3c）神经元中开始出现。伤后72小时，HSP70的表达在相同区域开始下降，但是仍较基线有所增加。神经元中HSP70 mRNA诱导的局部图形与CCI后蛋白表达图形相似，但是在齿状回、海马CA3区的外侧层（CA3a）只有HSP70 mRNA表达，却无蛋白表达［14］。而对于大鼠单纯型弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury,DAI）和复合型DAI（伴随其他损伤），HSP70表达趋势则相似。伤后30分钟无HSP70表达阳性的神经元出现，但是在伤后3小时，HSP70表达阳性的神经元数量开始增加，并于伤后24小时达到高峰（P＜0.01），伤后72小时开始下降（P=0.05）［15］。HSP70具有神经保护功能，各种损伤因素、应激激活受损的脑组织细胞中HSP70 mRNA转录，并逐渐开始HSP70蛋白的翻译、合成，但是蛋白质仅能在存活的细胞中合成，因此HSP70蛋白多在对各种损伤因素、应激敏感且存活的脑组织细胞中阳性表达，并且HSP70阳性表达的时间与细胞受损程度、敏感程度有关。

　　2.2  HSP70在脑损伤中表达的意义

　　脑损伤的神经细胞损伤程度是决定病情演变及预后的重要因素，对其伤后病情的诊断、程度及预后的判断十分重要。da Rocha等［16］对20名TBI男性患者（GCS 3～8分）血清HSP70浓度进行测定，并以8名健康男性志愿者作为对照组。结果显示，重度TBI患者的平均血清HSP70浓度显著增高（在入院时、入院后24小时、7天分别为97.6、48.1、39.2μg/L），死亡率为50%。入院时（平均入院时间：伤后10.8小时）大部分具有死亡征兆的患者血清HSP70浓度（平均143.5μg/L）较幸存者血清HSP70浓度明显偏高（平均51.6μg/L）。即初始血清HSP70浓度与死亡征兆显著相关，且在伤后20小时内，以62 μg/L为界限，血清HSP预测死亡率的敏感度为70%。因此血清HSP70浓度增高也许能作为男性重度创伤性脑损伤患者病情恶化的预测指标。

　　2.3  HSP70对脑损伤的保护作用机制 

　　脑损伤具有高致残率和死亡率，主要原因为脑损伤后继发性脑损伤。继发性脑损伤可由脑灌注压不足、脑组织氧代谢障碍、脑内过度炎性反应、受损脑组织对继发性损伤的敏感性增强、脑损伤后致伤因子的释放增加等多种原因引起，可通过不同途径加重脑损伤后的病理生理改变，其实质是脑组织缺血低氧［17］。那么，HSP70是怎样防止脑组织的缺血低氧性损伤呢？以往大量的研究表明，HSP70能对抗内源性损伤因子引起的毒性作用，清除细胞内异常的蛋白质，减轻损伤及应激反应引起的细胞膜蛋白的变性，保护脑组织细胞的蛋白，即HSP70具有分子伴侣的作用［5］。近来有研究表明，HSP70还具有抗凋亡作用。凋亡是脑组织缺血低氧性损伤后的主要病理改变，Kitamura等［18］研究发现，cJun氨基末端激酶（cJun Nterminal kinase，JNK）信号通路是导致创伤后神经细胞凋亡的重要途径之一，而HSP70是其中的一种抑制分子。HSP70还可以和一些凋亡前效应因子，包括凋亡诱导因子、凋亡酶激活因子（apoptotic protease activation factor1,Apaf1)等进行中和性的相互作用。细胞凋亡的线粒体途径是从凋亡基因分子释放入胞质内开始的，包括细胞色素C和凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor，AIF）。细胞色素C参与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）的激活，而AIF则直接转移至细胞核并触发caspase依赖的核改变。研究证实HSP70能减少线粒体膜上细胞色素C的释放，以防止线粒体复合物Ⅲ、Ⅳ之间的电子渗漏，维持线粒体膜电位，并通过增强线粒体抗氧化酶的活性，减少缺血样应激后氧自由基的形成，从而防止缺血低氧所致神经细胞中细胞色素C相关凋亡的发生［19］。HSP70同样能抑制AIF转移至核，而这与减少缺血性细胞死亡有关［20］。HSP70还通过直接与Apaf1关联，防止细胞色素C介导的caspase激活，从而阻止caspase向凋亡体复合物的聚集。Apaf1是通过caspase的补充区域（recruitment domain）与前caspase9结合，HSP70除了能抑制Apaf1的聚集外，还能竞争性抑制Apaf1同caspase9前体的结合，从而减少凋亡。HSP70还能通过其他方式干扰凋亡，如阻断Apaf1的形成、增强bcl2的表达等。在脑缺血再灌注损伤模型中，过表达HSP70的转基因小鼠的细胞色素C释放减少、Apaf1分离、caspase9的裂解（cleavage）减少，从而实现对脑组织的保护作用［21］。

　　3  小结与展望

　　HSP70无论在正常还是在应激情况下，对细胞的蛋白合成、损伤耐受均发挥着重要作用。HSP70在各种类型脑损伤中的表达不仅是细胞受损的标志，而且是脑损伤病情恶化的预测指标［16］。HSP70是重要的神经保护因子，有着防止迟发性神经元死亡、对抗氧化应激、抗凋亡等作用，它在防止细胞损害和促使受损细胞恢复方面的作用已得到公认。Kabakov等［22］通过基因技术，人工诱导脐静脉内皮细胞合成HSP70，有效地防止了血管内皮细胞因缺血再灌注损伤所致的凋亡，这为将HSP70应用于脑损伤的治疗提供了一个可借鉴的方法。随着基因技术、生物工程的发展，HSP70在脑损伤的治疗中将会有广阔的前景。

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