国产番泻叶的泻下及抗骨质疏松作用研究

  作者：何文斐作者单位：温州医学院 药学院，浙江 温州 325035   【摘要】  目的:探讨国产番泻叶的泻下及雌性激素样抗骨质疏松作用。方法:比较国产与进口商品番泻叶提取物对小鼠排便和肠蠕动作用的影响，观察其泻下通便的效果。并通过观察对去势雌性小鼠动情周期、子宫重、股骨重的变化和血钙、血磷、降钙素含量的影响，研究由国产番泻叶制备而得的番泻总苷提取物的雌性激素样抗骨质疏松作用。结果:两种商品番泻叶提取物与生理盐水对照组相比均能显著增加墨汁推进率、缩短首次排便时间，增加6 h排便量，两种商品之间无显著性差异。由国产番泻叶制备而得的番泻总苷提取物能缩短去势小鼠动情周期，有雌性激素样促进子宫增生和骨质钙化的作用。结论:国产番泻叶具有较好的泻下通便作用，并初步发现其具有雌性激素样抗骨质疏松作用。 【关键词】  番泻叶 泻下剂 骨质疏松    番泻叶(Folium sennae)为中国药典2005年版一部收载的常用泻下导滞药之一，为豆科植物狭叶番泻(Cassia angustifolia Vahl)或光叶番泻(C. acutifolia Lelile)的干燥小叶[1]。    番泻叶味甘、苦，性寒，有泻热行滞、通便的功能。主要用于治疗热结便秘、积滞腹胀。近些年来发现番泻叶可治疗流行性出血热、急性胰腺炎及中毒性肠麻痹等[2，3]。本品长期以来依靠进口，主要进口国是印度。20世纪80年代以来，我国在海南、广西等省引种成功，但商品售价仅为进口的1/3～ 1/2。国产番泻叶外观、性状、显微特征与进口商品无明显差异，但其有效成分的多寡和活性如何还需要进一步研究。为此我们课题组从化学成分、活性成分的定性定量以及药理作用等多方面进行一系列的比较研究。现将两种商品番泻叶提取物对小鼠排便和肠蠕动作用的比较及由国产番泻叶制备而得的番泻总苷提取物的雌性激素样抗骨质疏松作用的结果报告如下。    1  材料和方法    1.1  材料     1.1.1  动物：健康昆明种小白鼠，体重(20±2)g，雌雄兼用。进行雌性激素样抗骨质疏松作用研究时仅用雌性小鼠。由沈阳药科大学提供。    1.1.2  药材：药材A，产于我国海南省陵水地区，总番泻苷以番泻苷B计算为2.30%。药材B，印度进口，中华人民共和国进口药材批件受理号为：JZC2003292；天津药品检验所进口药品检验报告书编号为：20040112/13；检验结果含总番泻苷以番泻苷B计算为2.50%，收验日期：2004-09-02。两者经沈阳药科大学中药学院路金才副教授鉴定均为豆科植物狭叶番泻（Cassia angustifolia Vahl）的干燥叶。    1.1.3  试剂：含碳末的生理盐水，含碳末0.1 g/ml；含50%墨汁（5%炭末，10%阿拉伯胶制成的混悬液）生理盐水；乙醇；己烯雌酚；苦味酸染色剂。DA101大孔吸附树脂（辽宁鑫泰）。    1.1.4  仪器：超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-500DE型数控超声波清洗器；电子分析天平（Mettler AB204-A 上海）；冷冻干燥仪；计时器；注射器。    1.2  实验方法    1.2.1  供试样品的制备    1.2.1.1  样品制备原则：活性物质采用国际上通用的两种溶剂即乙醇和水提取制备[4]，乙醇的浓度根据文献采用65%[5]。    1.2.1.2  乙醇提取：分别取药材A和药材B各100 g，各加65%乙醇1 500 ml浸渍30 min后超声提取：超声功率为80%，超声温度为20 ℃，超声时间为10 min。减压回收乙醇各制成含生药2.0 g/ml。标记为：A-e（国产番泻叶乙醇提取物），B-e（印度进口番泻叶乙醇提取物）。    1.2.1.3  水提取：分别称取药材A和药材B各100 g，分别加蒸馏水1 500 ml浸渍30 min后超声提取：超声功率80%，超声温度20 ℃，超声时间10 min。减压浓缩各制成含生药2.0 g/ml。标记为A-w（国产番泻叶水提物），B-w（印度进口番泻叶水提物）。

 1.2.1.4  番泻总苷提取物制备：称取药材A 100 g，用65%乙醇加热回流提取，减压回收乙醇，调pH至7～8，通过DA101大孔吸附树脂纯化，流出液经冷冻干燥即得。临用前配成含生药2.0 g/ml的溶液。    1.2.2  对小鼠排便的影响[6]：取禁食24 h小鼠75只，随机分成5组，每组15只，用苦味酸标记。各给药组动物分别灌服A-e、B-e、A-w、B-w番泻叶提取物的碳末混悬液（含碳末0.1 g/ml），对照组给予生理盐水碳末混悬液（含碳末0.1 g/ml），给药容积0.3 ml/10g。给药后，每组小鼠分别置于铺有滤纸的安钟罩内进行观察，记录小鼠首次排黑色粪便的时间、粪便数量，并观察粪便性状以及粪便沾染肛门的情况，连续观察6 h。    1.2.3  对小鼠肠蠕动的影响[6]：取禁食24 h小鼠75只，随机分为5组，每组15只，用苦味酸标记。各给药组分别灌胃A-e、B-e、A-w、B-w四种供试样品（含50%墨汁），对照组给予含50%墨汁的生理盐水，给药容积为0.3 ml/10g。给药后30 min脱颈椎处死。打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部肠管，置于托盘上。轻轻将小肠拉成直线，测量肠管的长度作为小肠总长度，从幽门至墨汁前沿的距离作为墨汁在肠内推进的距离。利用如下公式计算墨汁推进的百分率，并注意观察各组小肠容积是否增大。墨汁推进率（%）＝墨汁在肠内推进的距离/小肠全长×100%。    1.2.4  雌性激素样抗骨质疏松作用研究[7,8]：将小鼠按体重随机分为5组，即假手术组、模型对照组、番泻总苷低剂量组（低剂量组，3.0 mg/kg）、番泻总苷高剂量组（高剂量组，6.0 mg/kg）、己烯雌酚组（2.0 mg/kg），每组15只。假手术组行双侧卵巢摘除假手术，另4组行双侧卵巢摘除术。术后5 d开始做阴道涂片，在给药过程中每天做小鼠阴道涂片观察动情期出现情况。以灌胃方式给药，每天给药1次，连续给药49 d，对照组给予等体积蒸馏水。于末次给药24 h后自眼眶取血，分离血清，测血钙、血磷和降钙素的含量，记录小鼠体重、副性器官子宫重和左侧股骨重，计算脏器系数。    1.2.5  统计学处理：数据处理使用SPSS12.0软件，多组间均数比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD法检验。    2  结果    2.1  国产与进口商品番泻叶提取物对小鼠排便的影响（见表1）  实验过程中观察了小鼠粪便的性状，对照组为成形的湿软的小枣状，各给药组均为不成形的稀便。    2.2  国产与进口商品番泻叶提取物对小鼠肠蠕动的影响（见表2）  实验过程中观察了肠容积的变化，除对照组不变外，其他组均明显增大。    2.3  番泻总苷对去势雌性小鼠动情周期的影响（见表3）  结果显示，模型对照组与假手术组间有显著性差异（P<0.01），与模型对照组比较，番泻总苷高低剂量组均可明显缩短去势小鼠动情周期（均P<0.01），表明番泻总苷具有雌性激素样作用。且番泻总苷高剂量组与己烯雌酚组比较无显著性差异（P>0.05）。    2.4  番泻总苷对去势雌性小鼠子宫重和左股骨重的影响（见表4）  结果显示模型对照组子宫系数和左股骨系数与假手术组间均有显著性差异（均P<0.01）；己烯雌酚组和番泻总苷高低剂量组子宫系数和左股骨系数与模型对照组之间均有显著性差异（均P<0.01），表明番泻总苷有雌性激素样促进子宫增生和使骨质钙化加重的作用。    2.5  番泻总苷对去势雌性小鼠血钙、血磷和降钙素含量的影响（见表5）  以血钙为指标，模型对照组与假手术组间差异有显著性（P<0.01）；番泻总苷高低剂量组与模型对照组间差异有显著性（P<0.01）。表明番泻总苷可以降低血钙，使骨质钙化。以血磷为指标，假手术组和给药组与模型对照组之间没有显著性差异。以降钙素为指标，与假手术组比较，模型对照组小鼠血清降钙素下降，番泻总苷组与模型对照组比较血清降钙素呈上升趋势，但没有显著差异。3  讨论    本研究所用样品番泻叶的活性成分，主要为番泻苷A和番泻苷B，采用国际上通用的乙醇和水两种溶剂提取制备。根据文献[6]的工艺考查，发现65%浓度的乙醇对番泻苷A、B提取效果最佳，故采用65%乙醇作为醇提取溶剂。    方法1中计数黑便时，应随时将小鼠排出的已计数的黑便清除，否则易混淆。方法2中实验动物选取成年体大的健康小鼠为好，肠管粗大易于操作。    在小鼠排便和肠道炭末推进法实验中，发现A-e、B-e、A-w、B-w各给药组小鼠排泄的黑便不成形，成稀软状，而且与生理盐水对照组相比两种番泻叶给药组均具有明显的增加排黑便数量，缩短首次排黑便时间和增大墨汁推进率的作用（均P<0.01），因此推断其作用机制可能与加强肠蠕动有关。此外，无论A-e组与B-e组还是A-w组与B-w组在两个实验中各项指标均无统计学差异，这表明国产番泻叶与进口番泻叶不仅外观性状鲜有差别而且有着基本相同的药效学作用。     本研究采用大孔吸附树脂法富集纯化番泻总苷，与单纯的乙醇或水提取方法相比，番泻苷纯度较高，一般番泻苷A、B之和可达20%以上。    骨质疏松是中老年，尤其是老年女性的常见病、多发病，因此对此病的防治已成为医学界普遍关注的重要课题。本实验观察到番泻总苷能缩短去势小鼠动情周期，有雌性激素样促进子宫增生和使骨质钙化加重的作用，提示了该药的雌性激素样抗骨质疏松作用。【参考文献】[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国药典 （一部）[M]. 北京:化学工业出版社,2005:242.[2] 肖培根. 新编中药志[M]. 第3卷. 北京:化学工业出版社, 2002: 509-514.[3] Leung AY,Foster S. Encyclopedia of Common Natural Ingre- dients [M]. New York: John Wiley & Sons,Inc,1996.472-473.[4] Rana KZ, Dudley MN. Human immunodeficiency virus pro-tease inhibitors[J]. Pharmacotherapy, 1999,19(1):35-59.[5] 邓远辉, 冯怡,黄家华. 番泻叶提取工艺研究[J]. 中国实验方剂学杂志,2004,10(1):20-21.[6] 陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 北京:人民卫生出版社, 1994: 203-208.[7] 孙敬方. 动物实验方法学[M]. 北京:人民卫生出版社,2001:423－426.[8] 施新猷. 现代医学实验动物学[M]. 北京:中国中医药出版社, 2000:130-131.