胚胎脊髓移植联合应用bFGF对脊髓损伤后 神经再生的影响

    作者：李新志，郑之和，卢国强，韩庆斌，李霏霰    （三峡大学仁和医院骨科，湖北 宜昌 443001）

    【关键词】  胚胎

    摘要: 目的   探讨胚胎脊髓（fetal spinal cord，FSC）移植联合外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fi-  broblast growth factor，bFGF）的应用对脊髓损伤后脊髓神经再生的影响。  方法   采用大鼠胸段（T   8    ～T    11    ）脊  髓左侧半横切损伤模型。移植供体为同种异体妊娠14天的孕鼠，将实验动物分为3组: A组为损伤+FSC  移植组; B组为损伤+FSC移植+bFGF组; C组为单纯损伤组。术后l～8周每周行综合行为评分（com-  bined behavioral score，CBS），评定大鼠功能，并取术后8周损伤区脊髓组织0.5cm作嗜银染色及NF200免疫  组织化学检查，分别标记轴突和胶质细胞，进行定量分析，观察神经纤维再生情况。  结果   胚胎脊髓移植和  外源性bFGF可以防止成鼠脊髓损伤后神经元的萎缩，图像分析发现其作用A、B组优于C组，可以较好地  恢复神经元形态。CBS评分提示大鼠神经功能的恢复也有同样趋势，治疗组统计学分析与对照组间有显著  性差异。免疫组织化学检查，术后8周A、B组神经中丝（neurofilament，NF）着色点较C组密集，且没有明显  的胶质增生。  结论   脊髓损伤后联合应用胚胎脊髓移植和bFGF可以防止神经元的萎缩，并且对神经纤维  再生及功能的恢复有促进作用。   

    关键词:  脊髓损伤; 胚胎; 脊髓移植; 碱性成纤维生长因子; 神经丝抗体200  

    Effects of transplantation of fetal spinal cord and basic fibroblast growth factor   on nerve regeneration after spinal cord injury    LI Xin-zhi，ZHENG Zhi-he，LU Guo-qiang，et al.   （Department of Orthopaedics，Renhe Hospital，Three Gorges University，Yichang 443001，China）  

    Abstract: Objective  To study the effects of transplantation of fetal spinal cord and basic fibroblast growth   factor on nerve regeneration in spinal cord after spinal cord injury in adult rats. Methods  Thirty-six Wistar rats   were divided into 3 groups: Group A，cord hemisection and fetal spinal cord grafting; Group B，cord hemisection，fe-  tal spinal cord grafting plus bFGF; Group C，hemisection of the cord only. After 1 to 8 weeks after injury，the rats   were examined by combined behavioral score（CBS）to evaluate the recovery of neurological function. The slides with   Nissl staining were used to measure the size of the neurons. The positive cells were quantitatively analyzed with a   computer image analysis system. The level of NF200 expression were detected by immunohistochemical method. Re-  sults  The transplantation of fetal spinal cord and basic fibroblast growth factor could prevent the atrophy of neurons   after spinal cord injury in adult rats. The size of neurons in group A and B were more than that of group C（ P <0.  05）. These increase in size of neurons was parallel to a significant improvement in neurological function. Conclu-  sion  The combination of the transplantation of fetal spinal cord and basic fibroblast growth factor can improve nerve   regeneration of spinal cord after SCI in rats. 

    Key words: spinal cord injury; fetal; spinal cord transplantation; basic fibroblast growth factor; NF200 

    有关研究认为，脊髓损伤的预后不良主要原因  为伤后继发性损害和神经再生困难，损伤后的轴突  再生，轴突发芽和轴突重建是成熟的中枢神经系统  中许多神经元回路的基本特征。自上世纪80年代  中期以来，国内外对胚胎脊髓移植治疗脊髓损伤进  行了大量的实验研究，证明了胚胎脊髓可以在宿主   中存活、发育、生长、分化并形成神经连接促进功能  恢复    ［1］    。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast   growth factor， bFGF）是一种能广泛促进来源于中胚  层及神经细胞层细胞增殖的生物活性物质，是一种  多肽生长因子、对神经具有保护作用，研究表明，鞘  内注射bFGF能显著减轻脊髓损伤后的组织损害并  起神经保护作用    ［2］    。本实验通过免疫组织化学方法  及特殊染色手段，观察大鼠脊髓胚胎移植联合应用bFGF对脊髓损伤后神经再生的影响。

    材料与方法   

    1  动物分组及模型的建立 

    1.1  健康Wistar大白鼠36只，雌雄不限，体重220  ～280g。随机分为3组: A组（治疗组）12只大鼠，  脊髓胸段半横切后，移植入胚胎脊髓组织; B组（治  疗组）12只大鼠，脊髓胸段半横切后，移植入胚胎脊  髓组织，并于蛛网膜下腔内置入内径0.6mm、外径  1mm的导管，术后每天经蛛网膜下腔导管注入20μl   bFGF（珠海东大生物制药有限公司生产，珠海东大  生物制药有限公司提供，含bFGF 100u），至术后8  周; C组（对照组）12只大鼠，脊髓胸段半横切后不  做移植。  

    1.2  0.3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔麻醉后以T    8      节脊髓为中心显露T    8    ～T    11    段脊髓，作为脊髓损伤  区，切开硬脊膜，将左侧的脊髓横向切断，用负压吸  引的方法损毁并吸除左侧半脊髓组织，造成1个约  2mm×2mm×2mm的创腔。胚胎脊髓供体为同种异  体妊娠14天的大鼠，显微镜下仔细切除颈胸段脊髓  约2mm，将胚胎脊髓表面的软脊膜等结缔组织切除  干净，然后用玻璃针头吸取合适大小的移植物植入  A、B组大鼠脊髓预置创腔中。B组经蛛网膜下腔置  入内径0.6mm、外径1mm的导管。  

    2  检测项目  

    2.1  取材及组织学检查: 术后8周，每组大鼠断头  处死，麻醉后，开胸行主动脉插管，4%多聚甲醛  500ml灌注过夜后，取损伤脊髓组织0.5cm，中性甲  醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，分别进行病理学观察  及Glees镀银染色。 

    2.2  联合行为评分: 联合行为评分（combined be-  havioral score，CBS）是Gale    ［3］    综合评定大鼠脊髓损  伤后功能评分方法，包括运动、感觉、反射以及肢体  动作协调等，最大值100分，表示神经功能100%丧  失，最小值0分，表示神经功能完全正常。损伤后即  刻进行评分，术后1、4、8周分别对每只大鼠评分。  

    2.3  NF200免疫组织化学检测: 按试剂盒（NF200  抗体，武汉博士德生物技术有限公司提供）使用说明  对脊髓组织切片进行轴突计数。  

    3  统计学处理  实验数据用单因素方差分析，采用 t检验进行  组间均数比较，以P <0.05表示差异显著。   

    结 果   

    1  病理学观察结果   胚胎脊髓组织移植后8周，移植组的24只动物  中，18只的移植组织存活，存活率75%，存活的移植  组织体积增大，充满移植腔，少数情况下，移植物与  宿主之间充满空腔或裂隙，只有部分相连。  

    1.1  移植组病理学观察: 损伤后8周，移植段脊髓  较正常段稍细，颜色变暗，脊膜完整，固定后标本纵  切面可见损伤段稍窄，中间有一个暗红色区域。镜  下可见移植物均存活，融合紧密，移植物与受体组织  融合良好，在缺乏移植物的损伤部位可以看到胶质  细胞增生带，在融合良好的部位没有大量胶质细胞  浸润。嗜银染色显示移植区内有大量纤细的神经纤  维，在宿主移植物界面可见大量宿主神经纤维越过  界面长入移植区内（图1）。  

    1.2  对照组病理学观察结果: 损伤后8周的大鼠脊髓  损伤段明显变细，呈暗红色，与正常段脊髓明显不同，脊  膜完整，与周围组织有黏连，固定后标本切面可见损伤  段变窄。镜下可见损伤段脊髓中有一个长圆形或不规  则的空腔，损伤腔边缘有胶质纤维瘢痕形成，损伤腔内  未见神经细胞及纤维，银染显示宿主神经纤维在损伤腔  边缘生长受阻、扭曲、未进入损伤腔（图2）。   2  NF200免疫组织化学染色结果  术后4周，移植组NF染色阳性的神经纤维在纵  切面上呈纵形排列、分布密集: 在横截面上呈点状  散在分布，并可见少量NF阳性纤维。术后8周，移  植组A、B组白质内可见大量、均匀的NF着色点，提  示神经纤维生长良好（图3、4），而对照组C组见散  在不均的神经纤维分布（图5），在损伤腔内未见NF  阳性细胞和纤维，在损伤腔边缘有少量NF纤维，杂  乱、扭曲、未能穿越胶质的细胞增生带而进入损伤  腔。经EPTON公司的IBAS-2000图像分析处理系  统进行轴突计数，发现治疗组A、B与对照组C差异  有极显著性意义，治疗组A、B无显著性差异（表1）。 

    表1   脊髓损伤后白质轴突计数（略） 

    讨 论 

    脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）研究的重点是  轴突再生。现在发现，再生轴突失败的主要原因归  因于两方面的因素: （1） 受损神经元所处的微环境  不利于其轴突再生，多种细胞因子明显上调，其诱导  的炎症反应在继发性损伤的病理过程中起重要作  用    ［4，5］   ，同时，CNS微环境中存在有抑制轴突再生的  化学因子，最近发现髓鞘内的Nogo蛋白及其受体  NgR对轴突的再生也起主要抑制作用    ［6］    ; 损伤部位  的反应性星形胶质细胞、小胶质细胞的浸润和巨噬  细胞等，在损伤区域形成胶质瘢痕，阻碍了轴突的再  生; CNS缺乏促进轴突再生的神经营养因子如神经  生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营  养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神  经营养素3（neutrophin 3，NT-3）等。这些神经营养  因子在抑制神经元死亡、促进轴突再生等方面有重  要作用。（2） 神经元损伤程度，在越靠近神经元胞  体的部位切断轴突，神经元越容易发生死亡而无法  再生。当然，仅有轴突再生尚不足以达到完整的功  能恢复，重要的是有序的神经再生，重建功能性突触  联系，恢复正确的神经传导通路。   近年来关于胚胎CNS移植的基础理论研究和  大量动物实验已经证实，同种异体胚胎脊髓移植于  成年动物脊髓半切损伤灶时，成活率可达70%～90%    ［7］    ，可以保护宿主残存神经元和轴突，替代宿主  神经元的功能或者与宿主脊髓之间建立新的神经纤  维联系，从而保存或恢复宿主脊髓的部分感觉、运动  和反射功能    ［7］    。本实验中75%的移植组织存活，并  与受体紧密融合。   胚胎脊髓移植对损伤脊髓的修复主要机制  为    ［1，8］    : （1） 作为连接损伤两断端的中继结构，引导  再生轴突越过损伤区，或与损伤轴突构成突触联系、  传导信息。（2）提供神经元，随着胚胎脊髓的分化  成熟，由原来的幼稚神经细胞分化为成熟的神经细  胞，并且发出神经轴突与损伤区周围的神经元、轴突  形成广泛的网状联系，恢复部分植物神经及反射功  能，此过程受宿主移植区环境的影响。（3） 胚胎脊  髓较成体脊髓组织含有更为丰富的神经营养物质，  植入后可提供优越的微环境，并在分化成熟的过程  中，分泌大量的神经营养因子，促进神经再生。Liu  等    ［9］    研究证实，胚胎脊髓植入损伤区后，移植物中  BDNF-mRNA、NGF-mRNA呈很强的原位杂交反应，  能明显促进红核脊髓束轴突再生，肢体运动功能明  显改善。（4） 减轻Waller变性，促进轴突再生。  （5） 抑制损伤区胶质瘢痕的增生，减少已形成的胶  质瘢痕，促进再生的轴突穿越胶质屏障。Miya等    ［10］      认为，移植的胚胎脊髓组织能允许下行系统影响马  尾脊髓，主要通过直接生长或损伤部位在胚胎脊髓  形成中继站。人类胚胎脊髓移植在应用于临床治疗  创伤性脊髓空洞症中，结果感觉和肢体痉挛状态有  明显改善    ［11］    。   近年来的研究表明，bFGF不仅参与神经组织的  修复，而且对损伤的神经细胞具有保护作用    ［12］    。  Teng等    ［13］    将bFGF注入成年大鼠胸髓损伤区，5周  后发现bFGF能促使脊髓前角运动神经元长期存  活，改善实验性脊髓损伤后的呼吸功能。在本实验  中，通过给予外源性bFGF，能减少神经元的死亡和  促进神经元的存活，并能诱导轴突向外生长等功能，  并利用胚胎脊髓移植创造一个减轻继发性损害，有  利于修复的微环境，二者协同作用来促进神经的生  长和修复，促进成年大鼠损伤后后肢功能的恢复和  改善，其效果要更明显。本组的病理学观察也提示，  移植组的神经生长活跃，同时根据CBS评分，损伤  后即刻各组都丧失了90%以上的功能，移植各组术  后4周功能恢复比较快，FSC+bFGF组恢复最快，术  后4周已恢复了75%的功能，FSC组恢复了70%。  至术后8周FSC+bFGF组恢复了85%的功能，而单  纯移植组恢复了76%。脊髓损伤后8周白质轴突计   数FSC+bFGF也高于FSC组，二者间虽无显著性差  异，但为今后的脊髓损伤治疗提供了新的思路。

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