氧张力与软骨组织工程

作者：陈书军   【关键词】  氧张力；软骨；组织工程

　　摘要：  氧是细胞成活和调节细胞代谢的重要因素。软骨组织一直被认为是一种缺氧组织，正常关节软骨没有血管供应，其氧供只能依靠周围滑液的渗透作用。目前软骨组织工程种子细胞基本采用标准氧培养环境，氧张力为20%~21%，距体内正常软骨细胞和间充质干细胞氧张力环境有很大差距。本文综述了近年来有关氧张力对软骨细胞和间充质干细胞生物学作用的研究进展。

　　关键词：氧张力；软骨；组织工程

　　Oxygen tension and cartilage tissue engineering

　　CHEN Shujun，JI Ning，PEI Guoxian

　　(Center of Tissue engineering Research,Southern Medical University,Department of Orthopedics and Traumatology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou  510515,China)

　　Abstract：  Cartilage has often been thought of as an anaerobic tissue. However,oxygen levels in standard culture conditions is 20%21%,which is hyperphysiologic for cartilage tissue engineering cell types,including chondrocytes and bonemarrow derived MSCs.As a regulating agent of chondrogenesis,oxygen has gained increasing attention.This article reviewed the development of oxygen levels in cartilage tissue engineering.

　　Key words:oxygen tension;cartilage;tissue engineering

　　关节软骨愈合能力有限，软骨组织工程研究的发展为关节软骨缺损的治疗提供了新的治疗手段，使软骨组织缺损的完全再生成为可能。考虑到潜在的免疫排斥反应和疾病交叉感染，目前的种子细胞研究倾向于自体细胞来源。自体细胞的研究内容涉及细胞的获取、扩增和表型稳定性保持以及细胞移植后的功能表达。自体细胞来源主要包括软骨细胞和间充质干细胞［1，2］。间充质干细胞（MSCs）是一种多能干细胞，具有多项分化潜能，研究表明经特异诱导后具有向软骨细胞分化的趋势。骨髓MSCs获取简单，创伤小，取材简单不受限制，增殖能力强，在经过多次传代后仍具有软骨细胞分化能力，具有临床实用价值，成为近年来软骨组织工程种子细胞来源的主要研究方向［3］。组织工程方法修复软骨缺损必须有大量的表型稳定的细胞为基础。然而，体外传统的培养方法去分化为成纤维细胞，其特征性标志物蛋白（Ⅱ型胶原）表达下降，非透明软骨细胞的型胶原蛋白表达增加。三维培养环境，如藻酸盐和琼脂糖凝胶，可阻止或延缓软骨细胞的去分化，甚至可使去分化的软骨细胞恢复软骨细胞表型，但扩增环境也可影响扩增后细胞的分化。间充质干细胞能够诱导分化为软骨细胞，但在多项研究中发现其诱导率和稳定性仍停留在较低水平［4］。涉及到细胞的表型分化和扩增问题，模拟体内环境进行细胞体外培养受到越来越多的关注。体外细胞的生长特征受很多因素的影响，包括细胞接种密度、培养介质的调节以及氧张力［5］。氧张力研究是其关键问题之一。

　　1  软骨组织氧张力

　　氧是细胞成活和调节细胞代谢的重要因素。软骨组织被认为是一种缺氧组织，正常关节软骨没有血管供应，其氧供只能依靠周围滑液的渗透作用。动脉供氧一般氧张力＞12%，而在滑液中氧张力处于较低水平（约7%）。关节滑液中的氧由关节表面向深层渗透，随着软骨细胞的消耗，由浅及深，软骨细胞周围的氧张力也逐渐下降。因此关节软骨表面的氧张力大约为5%~10%，而深层可能＜1%［6］。软骨细胞包埋于无血管的基质中，其周围的氧压更低，依靠缺氧代谢维持细胞的正常生理功能。在创伤性关节炎中，滑膜炎可消耗更多的氧，由此降低了关节滑液中的氧张力［7］。在骨性关节炎中，从滑膜毛细血管转入滑液的氧也减少。这些资料表明，软骨细胞在正常的生理状态下处于缺氧状态，在疾病的进展过程中，缺氧更加严重。目前软骨细胞和间充质干细胞基本采用标准氧培养环境，氧张力为20%~21%。标准培养初始是应用于细胞系和成纤维细胞的培养，成纤维细胞在这种培养条件下也很容易获得足够的扩增，其他的细胞类型，如角朊细胞需要特殊的培养条件以避免过早衰老，但标准培养环境距体内正常软骨细胞和间充质干细胞氧张力环境有很大差距。氧虽然是细胞必需的营养成分，但过高的氧浓度会对细胞造成损害。有研究表明组织内氧过多会增加自由基的产生，从而损伤蛋白和DNA，诱发细胞坏死和凋亡。软骨细胞氧过多同样会抑制基质的合成以及蛋白和DNA的合成［8］。关于体外培养造成的氧张力改变会对软骨和间充质干细胞产生何种影响的问题已受到学者们的极大关注。

　　2  氧张力与软骨细胞增殖组织工程方法

　　修复软骨缺损必须要有足够的细胞作为基础，细胞的大量扩增也是不可避免的问题。目前有关氧张力对软骨细胞体外增殖影响研究结论不尽相同。部分学者报道低氧浓度可刺激软骨细胞的增殖，也有报道认为存在抑制性影响。在Malda等［9］的研究中，软骨细胞在微载体上保持圆形，细胞展示明显的厌氧代谢。在4%~21%不同氧浓度条件下，细胞的增殖和氧耗量均未见明显差异，软骨样组织的形成也未有不同，认为氧张力对软骨细胞的增殖不存在明显影响。造成这种差异的原因目前认为有以下几种：（1）培养方法不一，在震荡培养中细胞周围氧张力更加接近于气相环境，而单层培养由于氧在液体扩散中的限制，细胞接触的氧张力水平并不等同于其气相中在氧张力，另外细胞初始接种浓度和培养液量也会造成氧张力的变化；（2）物种间存在的差异［10］；（3）细胞初始接种浓度以及细胞在不同培养条件下的衰老情况存在差异，造成细胞外基质合成不同，从而影响到细胞的增殖能力。体外培养的细胞由于端粒损伤，不可避免的衰老。细胞衰老造成群体倍增（PD）限制，从而终止了细胞的增殖。在标准培养条件下，人软骨细胞和MSCs仅有10~40倍增能力，距临床需要大约60倍增尚有差距。相比较体内软骨组织的氧张力水平，标准条件下过高的氧张力可能影响细胞的体外增殖能力。MoussaviHarami等［11］研究了在21%和 5%氧张力条件下，人MSCs和软骨细胞的增殖潜能，结果表明软骨细胞在标准氧张力培养条件下获得2530 PD后开始衰老，而低氧张力条件下可达到60PD，21%氧张力培养的软骨细胞产生的氧代谢物高于5%氧张力。BMSCs的生长对氧张力的变化同样敏感，在高氧张力条件下培养，MSCs很少能达到10PD，而低氧张力下可达到20PD，接近2倍。MoussaviHarami等［11］的研究表明氧张力是影响软骨细胞和MSCs过早衰老的关键因素，降低培养箱中的氧浓度可能是解决细胞扩增问题的重要手段。Martin等［12］对人软骨细胞的低氧张力培养研究也证实了其对软骨细胞的增殖潜能是有利的，而过高的氧浓度会对细胞的DNA产生损伤。

3  氧张力与软骨细胞表型分化

　　修复软骨缺损的种子细胞还必须保持稳定的软骨细胞分化表型，包括关节软骨细胞特异性标志物Ⅱ型胶原和GAG的合成，以及去分化细胞的逆分化表达。软骨细胞传代后容易发生表型变异，早期的研究已经证明低氧张力能够延缓软骨细胞衰老，并且有利于保持细胞的表型稳定性。在多空胶原海绵培养细胞，培养液灌注有利于保持多种细胞类型的表型稳定性，比如成纤维细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞和表皮细胞。但培养关节软骨细胞时，对软骨的形成有抑制作用，而当在5%的氧张力培养培养条件下，可重新恢复软骨形成功能，此表明氧张力对软骨细胞的表型稳定性有潜在的影响。Murphy等［13］的研究指出5%的氧张力不但有利于细胞Ⅱ型胶原的合成，而且能够促进去分化的软骨细胞重新表达软骨细胞特异性蛋白。大部分的研究结果都认为低氧条件可模拟体内的软骨环境，支持低氧张力条件下培养促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖。但也有部分持不同观点的报道，认为这也有可能是由于培养方法和物种差异所造成的。在软骨器官培养的研究中，低氧环境展示了有利的作用。另外有研究显示，降低氧张力有利于促进软骨软骨细胞特征性标志物重新表达，并缩短重新表达过程［14］。利用单层培养的软骨细胞能够迅速大量扩增的特点，传代后获得足够细胞数量，在藻酸盐凝胶系统中培养，恢复软骨细胞表型，再利用钙离子螯合剂溶解凝胶释放软骨细胞，如果应用于人的软骨细胞，可以获得足够软骨细胞用于软骨构建与修复，具有巨大的临床应用价值。Kurz等［15］首次报道了在低氧张力培养条件下，人软骨细胞的基质合成和表型稳定性。将原代牛和人软骨细胞分别在5%~21%氧张力条件下单层培养或接种于胶原膜和藻酸盐中体外培养2周。在21%氧张力下，单层培养的牛软骨细胞发生去分化，而低氧张力在胶原膜上培养，Ⅱ型胶原表达增加，Ⅰ型胶原表达下降，而在藻酸盐中培养这种作用更为显著。牛和人软骨细胞低氧张力培养，其生物基质的合成增加，并且去分化的软骨细胞重新表达软骨细胞表型。但在高氧张力条件下或单层培养中未发生这种现象。可以推断在模拟体内氧张力环境下，有利于软骨细胞表型稳定性和基质合成。

　　4  氧张力与软骨细胞基质

　　低氧张力培养也有利于软骨细胞外基质的合成。在牛软骨细胞体外培养研究中发现， 5%低氧张力条件下培养可合成最多的蛋白多糖（PG），而其他一些报道显示生长板软骨细胞在3%的氧张力下PG的合成最佳［16］。以藻酸盐为载体培养牛关节软骨细胞在10%氧张力下PG的合成最佳。另一方面，当氧张力＜1%时，PG合成下降，细胞的代谢活性也下降。在牛关节软骨器官培养中也发现类似结果。在最近组织工程软骨体外培养中，低氧张力条件下软骨组织中的细胞形态、分布以及基质合成较高氧张力更为接近自体软骨。对于氧张力影响软骨细胞活性和基质合成的机制尚不清楚。Matsushita等［17］研究了缺氧条件下过高氧张力对软骨细胞产生的损伤。牛软骨细胞在5%氧张力下保持最佳的PG合成，缺氧状态诱导软骨细胞产生NO，对软骨细胞起到保护性作用，当NO合成受到抑制时，PG合成下降，而21%氧张力培养下，由于过氧化氢的产生，限制了细胞PG合成。

　　5  氧张力与间充质干细胞

　　低氧张力在一定程度上可以潜在地诱导间充质干细胞分化为软骨细胞。早在1962年Bassett就认为体外培养的胚胎干细胞在较高的氧张力（(35%)环境下可形成骨，而在较低的氧张力环境下形成软骨。MoussaviHarami的研究表明氧张力BMSCs（BMSCs）在低氧张力条件下培养能够延缓细胞的衰老，提高细胞的增殖潜能。脱矿骨粉对BMSCs和胚胎干细胞具有软骨和骨诱导作用，已经被用于组织工程研究。利用含有脱矿骨粉的三位多孔胶原海绵培养人皮肤成纤维细胞，可使其向软骨细胞分化。Mizuno等［18］研究了低氧张力是否会促进体外培养的hDFs软骨形成，结果显示缺氧刺激缺氧诱导因子的表达对细胞的成活和增殖没有明显影响，并可增加软骨基质的合成。D'Ippolito等［19］从椎体获取BMSCs，模拟体内氧环境，在低氧张力（3%）条件下培养扩增，并研究了扩增后的分化潜能，结果显示BMSCs生长良好，并具有很强的增殖能力。细胞表面表达胚胎肝细胞性质的多种不同胚层标志物的继续标准培养分化研究显示其能成功分化成为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和神经细胞等，表明低氧张力环境并不影响MSCs的增殖能力和分化潜能。另外，利用三维立体支架培养BMSCs，细胞展示了软骨形成潜能［20］。对氧张力在间充质细胞分化方面的影响有学者持不同观点。骨膜细胞或组织中含有未分化的间充质细胞，在体外和体内能够形成软骨组织。O'Driscoll等［21］ 采用不同氧浓度条件（(1%~90%)）培养骨膜，观察软骨的形成情况，6周后进行形态学和胶原含量分析，发现在12%~15%浓度氧培养软骨形成最佳，在12%~45%之间无明显变化，而在高于90%和低氧环境下(1%~5%)软骨和Ⅱ胶原的形成被抑制，由此认为软骨形成需要需氧环境。在胚胎发育期，软骨细胞来源于间充质细胞，在长骨发育过程中，软骨区的氧张力是不同的，在增殖区大约是7.5%，在肥大带则为3.2%左右。Feinberg的一项动物研究表明在间充质发育成软骨的过程中，血管逐渐退化，由此推断因血管退化造成的氧张力改变可能在这个过程中决定细胞的分化类型。1970年Caplan报道，高密度培养间充质前体细胞分化为软骨，现在推测一部分原因可能是由于高密度细胞接种创造了低氧张力条件造成的。最近，Robins等［22］初步研究了低氧张力培养对间充质干细胞的分化影响，发现低氧张力有利于软骨表型的表达。综上所述，模拟体内软骨氧张力环境进行软骨组织工程种子细胞体外培养已逐渐受到国外学者的重视，但研究结果对细胞的生物学作用方面尚存在争议，认为可能是由于不同的培养环境所造成的，因此，关于氧张力在软骨组织工程中的应用还有待于系统性研究。

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