神经营养因子对大鼠损伤脊髓神经元的影响

　　作者：张强　廖维宏　伍亚民　陈恒胜　李应玉　作者单位：张强(泰安市解放军第88医院骨科)　廖维宏(400042　重庆，第三 军医大学野战外科研究所)　伍亚民(400042　重庆，第三 军医大学野战外科研究所)　陈恒胜(400042　重庆，第三 军医大学野战外科研究所)　李应玉(400042　重庆，第三 军医大学野战外科研究所)

　　〔摘要〕　目的　探讨神经营养因子防止成鼠脊髓轴突损伤后引起神 经元萎缩的作用。方法　采用改良的Allen's打击法致伤大鼠脊髓（25cmg ），将实验动物分为5组，A组：单损伤组；B组：损伤+NGF组；C组：损伤+CNTF组；D组： 损伤+NT-3组；E组：损伤+BDNF组。手术后应用行为学和电生理检查观察大鼠功能恢复情况 ，应用尼氏染色方法观察神经元的大小，采用计算机图像分析技术，进行定量分析。结果　神经营养因子可以防止成鼠脊髓轴突损伤后引起的神经元萎缩 。图象 分析发现其作用为E>D>C>B>A，E组效果最好，可以较好地恢复损伤神经元的形态。大鼠神经 功能的恢复也出现了相同的变化趋势。结论　神经营养因子能维持神经元 的细胞形态，对成鼠损伤脊髓功能恢复有很好的促进作用。

　　〔关键词〕　脊髓损伤　神经营养因子　神经元

Effects of Neurotrophic Factors on Reversing the Axotomy I nduced Neurons Atrophy of Adult Rats with Injured Spinal Cord

Zhang Qiang,Liao Weihong,Wu Yamin，et al.(Research Institute of Surgery,Third Military Medical University, Chongqing　400042)

〔Abstract〕　Objective　To explore the effects of neurotr ophic factors on reversing the axotomy-induced neurons atrophy of injured spinal cord in adult rats. Methods　The adults rats received lumbar s pin al cord contusion.Experimental rats were divided into five groups:Group A:spinal cord contusion only；Group B:spinal cord contusion plus NGF；Group C:spinal cor d contusion plus CNTF；Group D:spinal cord contusion plus NT-3；Group E:spinal c ord contusion plus BDNF.After operation combined behavioral score (CBS),somatose nsory evoked potentials (SEP),motor evoked potentials (MEP) were examined.Rats w ere killed after 1,3,7,14 days.Nissl stained section was used for neurons quanti tative image analysis.The positive cells were quantitative analysis by a compute r image analysis system. Results　The cell sizes of neurons sequ ence were found in five groups, they are E >D> C>B>A (p<0.05).These increases in cell size of neurons were paralleled by a significant improvement in neurologic al function recovery. Conclusion　It indicates that the neurotro phic factors can maintain the neurons morphology and improve rats hind limb func tion.

　　〔Key words〕　Spinal cord injury　Neurotroph ic factor　 Neuron

　　研究证实神经营养因子在体内和离体的情况下,都具有维持损 伤脊髓神经元的存活,促使轴突延伸等功能〔1～4〕。然而神经营养因子对脊髓损伤 后损伤区神经元的影响研究较少，本实验的目的是应用神经生长因子（NGF）、睫状神经生 长因子（CNTF）、神经营养因子-3（NT-3）、脑源性神经生长因子（BDNF），观察是否能 够挽救脊髓损伤引起的神经元萎缩并促进脊髓功能的恢复。

材料与方法

1　动物分组　　Wistar成年大鼠，体重180～250g，雌雄不拘。每个时相点每组6只动物，正常对照组6只 动物，共126只大鼠。随机将动物分为5组，A组：单损伤组；B组：损伤+NGF组；C组：损伤+ CNTF组；D组：损伤+NT-3组；E组：损伤+BDNF组。手术后1、3、7、14天应用行为学和电生 理检查观察大鼠功能恢复情况，应用尼氏染色方法观察神经元的大小。2　手术方法　　戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射麻醉，腰背部脱毛，无菌条件下暴露脊髓腰膨大。应用改 良的Allen's打击法致伤脊髓（25cmg）。神经营养因子各组，在大鼠脊髓的蛛网膜下腔置管 每天注射100ng神经营养因子，A组注射等量生理盐水。3联合行为评分（CBS）　　应用Gale〔5〕综合评定大鼠脊髓损伤后功能评分方法，包括运动、感觉、反射以 及肢体动作协调等方面。最大值是100分表示神经功能100%的丧失，最小值0分，表示神经 功能完全正常。4　诱发电位检查　　应用第三军医大学野战外科研究所研制的多功能神经诱发电位仪检查。动物麻醉后，选择 右侧坐骨神经和对侧大脑皮层运动区分别进行电刺激，记录感觉诱发电位(SEP)和运动诱发 电位(MEP)波形曲线，计算波峰和潜峰时。刺激频率4Hz，波宽0.2ms。强度40～60mv， 信号经前置放大器放大10万倍，计算机叠加300次。5　图象分析　　手术后1、3、7、14天每组麻醉6只受体大鼠，开胸暴露心脏，经左心室-主动脉插管，灌 注生理盐水200ml，然后灌注4%多聚甲醛200ml。灌注固定2小时后，取出损伤部位及其头尾 侧各3个节段的脊髓，投入相同固定液中再继续固定24小时，修剪后石蜡包埋，每个标本损 伤区及头尾侧各取1张切片，每组6个标本共18张切片，随机计数600个神经元，切片经计算 机图像分析系统处理，测定上述Nissl染色标记神经元的平均面积，并经t检验。

结果

1　正常对照组平均脊髓神经元体积是388.34±10.18，手术后1，3，7，14天应用神 经营养因子各组平均脊髓神经元面积如下(见表1)。

表1　各组平均脊髓神经元面积（±s μm2 ） 

大鼠数 手术时 间(天) 1 3 7 14 A组 6 174.34±8.18 171.56 ±7.90 215.53±8.25 252.78±8.68 B组 6 198.48±6.59 202.74±7.16 237.58±7.64 289.86±8. 85  C组 6 206.58±7.34 259.67±7.63△ 302.54±8.45△ 312. 96±8.36 D组 6 210.87±7.12 279.38±7.67△ 315.67±8.37☆ 321. 49±8.26△ E组 6 215.65±7.44 280.85±7.83☆ 329.47±8.26☆ 346. 52±9.49☆

　　各组与A组比较t检验　　☆：P<0.01　　△：P<0.052　联合行为评分（CBS）：正常组CBS为0分，损伤即刻评分为92±6. 26, 手术后1、3、7和14天各组CBS评分均有恢复(见表2)。

表2　各组CBS评分（±s） 

大鼠数 手术时间 (天) 1 3 7 14 A组 6 88.34±5.18 71.56±5.50 62.78±4.68 37.89±4.56 B组 6 85.47±5.24 68.78±4.03 52.96±3.75 31.53±2.67 C组 6 83.54±5.04 62.65±3.53△ 44.86±3.56 27.47±2.76 D组 6 78.87±4.52 55.68±4.17△ 32.69±2.89△ 20.73± 2.46 E组 6 74.68±4.44 49.47±6.82△ 28.12±3.49☆ 18.23± 2.23△

　　各组与A组比较t检验　　☆：P<0.01　　△：P<0.053　正常对照组SEP和MEP分别是1.48±0.46和2.31±0.26，手 术后1、3、7、14天应用神经营养因子各组SEP和MEP检查结果(见表3)。

表3　各组MEP和SEP潜峰时（±s ms） 

大鼠数 MEP SEP 3天 7天 14天 3天 7天 14天 A组 6 5.45±0.82 4.26±0.62 4.5 0±0.65 4.90±1.54 4.43±1.65 3.81±1.62 B组 6 4.48±0.66 3.48±0.46 2.18±0.46 3.31±0.26 2.84±0.26 2.31±0.26 C组 6 4.10±0.53 3.75±0.61 2.02±0. 41△ 3.30±0.41 3.12±0.50 2.61±0.45 D组 6 3.64±0.52 2.31±0.48△ 1.86±0.40☆ 3.12±0.62  2.89±0.47 2.45±0.34 E组 6 3.35±0.55 2.17±0.42△ 1.66±0.38☆ 3.08±0.44 △ 2.54±0.52 2.40±0.36

　　各组与A组比较t检验　　☆：P<0.01　　△：P<0.05讨论

　　神经营养因子作为一类小分子肽类物质,主要包括有神经生长因子家族(NGF、BDNF、NT- 3、NT4/5、NT-6)以及CNTF、GDNF、IGF、bFGF,白介素类等。经过二十多年的研究,对其生 物学作用逐渐加深了认识。 在成年动物，神经营养因子维持靶神经元及其相连神经元的存 活及正常的生理功能，损伤后神经营养因子在一定的条件下，可促进未损伤的神经元生芽而 重建被破坏的神经回路，神经营养因子在体内和离体的情况下,都具有维持损伤脊髓神经元 的存活，促使轴突延伸等功能〔1～4〕。NGF是神经系统最重要的生物活性因子之一, 有促进和维持神经细胞生长、生存、分化和执行功能的作用。NGF主要对脊髓中感觉、交感 神经元起作用，对前角部分运动神经元也有一定作用。BDNF和NGF有50%的同源性，对多种感 觉神经元，胆碱能神经元，多巴胺能神经元以及GABA能神经元的发育分化与生长再生具有维 持和促进作用, 在阻止损伤后运动神经元死亡的作用上,NT-3与BDNF有相同效应。在发育中 及成熟后的大鼠中,NT-3能促进脊髓损伤后皮质脊髓束的生长,且能阻止大鼠发育中损伤红 核神经元的退行性死亡。NGF，BDNF，NT-3可以挽救轴突切除的前脑神经元并能促进神经元 的再生〔6〕。CNTF与运动神经元关系密切。对培养的鸡胚运动神经元，CNTF是最有 效的神经营养因子。CNTF能减少新生鼠面神经切断后运动神经元在终板区发芽，与运动神经 元的功能维持有关〔7〕。另外的研究表明神经营养因子能维持Ca2+稳态，NGF 、BDNF、NT-3均可减少由于缺少葡萄糖所引起的培养鼠海马隔区或皮质神经元中Ca2+ 的升高，还可以减少自由基的损伤〔8,9〕。

图1　大鼠脊髓损伤后14天，损伤+BDNF组脊髓灰质神经元Nissl 染色,神经元已恢复正常，神经元轮廓清楚，尼氏体呈网斑状排列于核周。×200

图2　大鼠脊髓损伤后14天，单纯损伤组脊髓灰质神经元Nissl染色，神经元数量减少，神经元萎缩轮廓不清楚，尼氏体溶解，核固缩。×200

　　尼氏染色的结果能较好地反映脊髓灰质病理改变情况。大鼠脊髓损伤后1天，神经元出现 明显的核固缩，尼氏体溶解，神经元数量明显减少，神经元萎缩变小。手术后7天神经元继 续萎缩，数量减少。14天时残存一些萎缩的神经元，仅有少数神经元形态恢复。大鼠脊髓损 伤后应用神经营养因子，神经元萎缩减少，神经元形态有不同程度的恢复，总体趋势为E> D>C>B>A。应用BDNF和NT-3组效果较好，大鼠脊髓损伤后14天，萎缩神经元有80%恢复了正 常 的形态。应用CNTF和NGF组效果稍差，也有大约70%萎缩神经元恢复了正常形态。大鼠运动功 能恢复也出现了相同的变化趋势。我们的实验结果表明，大鼠脊髓损伤后应用神经营养因子 对神经元有保护作用，不仅有利于神经元的存活，而且能够促进大鼠运动功能的恢复。

参　考　文　献

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